雷公藤红素抑制反式维甲酸引起的分化综合征及信号转导机制研究

摘要

急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukeamia, APL)是急性髓性白血病的特殊亚型。早期APL的治疗方案以葸环类药物联合阿糖胞苷为主,但其完全缓解率很低,且在治疗过程中,常因并发性弥散性血管内凝血或原发性纤维蛋白溶解引起严重出血,最终导致患者早期死亡。
　　 反式维甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)是APL治疗效果显著提高的里程碑式药物。ATRA能诱导APL细胞分化和凋亡,使APL患者得到有效治疗,患者4-5年无疾病生存率达70-80％。目前,ATRA已成为治疗APL的首选药。但在ATRA治疗APL过程中,约四分之一的患者会发生分化综合征(differentiation syndrome,DS),这是一种能导致死亡的严重副作用,主要表现为呼吸窘迫,不明原因发热,体重减轻,间质性肺浸润,胸腔或心包积液,高血压和急性肾衰竭,其中肺浸润最为常见。及早明确诊断DS和应用地塞米松等激素进行治疗,可降低DS的相关死亡率,但DS的早期明确诊断相当困难,而且由于激素的毒性大而不能常规使用以预防DS的发生。因此,揭示DS的发生机制,寻找有效预防或治疗该综合征的方法,成为目前亟待解决的一个重要课题,受到研究者的高度关注。
　　 DS临床病理特征是微血管损伤,主要表现为水肿、出血、纤维蛋白渗出、白细胞浸润等,显示DS的类似炎症的病理表现。应用地塞米松进行治疗有效,亦佐证该综合征具有炎症性特征。但导致这种病理改变的机制尚未完全明确,目前的研究普遍认为,该综合征的发生,至少涉及三个环节:首先是血管内细胞聚集增加。APL细胞被ATRA诱导分化成熟过程中,其表面与细胞粘附、聚集相关的重要粘附分子,如细胞间粘附分子(intercellular adhesion molecular1,ICAM-1)表达升高,APL细胞间(自血病细胞/白血病细胞)相互粘附能力增加,导致细胞聚集,引起小血管血流变慢,甚至阻塞。其次是细胞出血管能力增加。APL细胞被ATRA诱导分化成熟后,表面粘附分子表达增加,与血管内皮细胞的粘附能力增加,助长其出血管;体内外阻断ICAM-1的表达,能减轻ATRA导致的白血病细胞粘附力与肺浸润。最后是进入组织后的细胞炎症反应能力增加。被ATRA诱导分化成熟后的APL细胞,能分泌引起炎症反应的因子和酶,大量进入组织后,启动类似炎症的反应,能造成组织损伤。因此,阻断上述环节,如阻断粘附分子的表达、抑制细胞释放炎症因子,被认为能用于治疗DS。
　　 雷公藤系卫矛科植物,长期以来作为治疗风湿性关节炎等自身免疫性疾病的药物。雷公藤红素是从雷公藤中提取的一种三萜类单体,有很强的抗炎症作用。多种动物疾病模型证实,雷公藤红素对胶原性关节炎、哮喘、系统性红斑狼疮、阿尔茨海默病等有显著的治疗作用。细胞和分子生物学研究显示,雷公藤红素能抑制炎症因子如TNF-α和IL-1β等的合成与释放;阻断炎症因子与其靶结合引起的效应,如炎症因子能引起内皮细胞活化、表达ICAM-1, VCAM-1和E-selectin等粘附分子,而雷公藤红素对此有强烈抑制作用。
　　 本课题组在前期研究中用炎症因子刺激原代培养的人脐静脉内皮细胞HUVEC建立炎症反应模型,结果发现,雷公藤红素能阻断炎症因子导致的内皮细胞表达粘附分子ICAM-1、VCAM-1和E-seleetin,并阻断活化内皮细胞与白细胞的粘附,其阻断作用远远强于地塞米松、布洛芬等常用抗炎症药物。鉴于ATRA诱导引起的白血病细胞表面多种粘附分子的表达及多种炎症因子的分泌,是DS肺浸润的分子基础,我们用急性早幼粒细胞白血病细胞系NB4为细胞模型进行研究,发现雷公藤红素能抑制ATRA导致的白血病细胞与内皮细胞的粘附增加。
　　 基于上述结果,我们提出了雷公藤红素治疗DS的设想。本课题在证实雷公藤红素不影响ATRA诱导细胞分化效果,但能抑制ATRA治疗产生的致命副作用-分化综合征的基础上,深入分析了其作用的机制。
　　 一、雷公藤红素抑制反式维甲酸引起的分化综合征
　　 本课题组前期研究发现,雷公藤红素能抑制ATRA导致的白血病细胞与内皮细胞的粘附增加,提示雷公藤红素可能用于治疗分化综合征(DS)。但雷公藤红素是否会干扰ATRA诱导APL细胞分化这一治疗效果？本部分研究首先用细胞形态学、生化指标、分子标志等指标,观察雷公藤红素对NB4细胞分化成熟的影响。结果表明在细胞形态上,雷公藤红素不影响ATRA导致的NB4细胞的胞浆量增多,细胞核出现核偏位,有些胞核由凹陷变为肾形,甚至出现杆状或分叶核等粒细胞系分化的形态学特征。在硝基蓝四氮唑蓝(NBT)还原功能上,雷公藤红素能协同ATRA诱导的NB4细胞的NBT还原反应能力。在调节分化抗原表达上,除了CD33外,雷公藤红素对ATRA导致的NB4细胞膜表面分化抗原CD11b、CD13和CD15变化没有影响。结果表明雷公藤红素对ATRA导致APL细胞分化成熟的能力没有影响。
　　 雷公藤红素能抑制ATRA导致的白血病细胞与内皮细胞的粘附,同时又不会影响ATRA诱导白血病细胞分化成熟。因此,雷公藤红素能否作为治疗DS的新药物,值得进一步研究。我们按文献构建DS小鼠模型,将体外诱导分化的NB4细胞尾静脉注射入重症免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠,再口服ATRA或者腹腔注射雷公藤红素,组织化学检测雷公藤红素抑制ATRA诱导白血病细胞浸润肺部的效果。结果发现,ATRA能引起细胞肺浸润,这种细胞浸润可被雷公藤红素抑制。
　　 以上结果表明,雷公藤红素不影响ATRA诱导NB4细胞分化成熟作用但在体内能抑制ATRA诱导的肺浸润。
　　 二、雷公藤红素通过抑制反式维甲酸诱导ICAM-1表达而减轻分化综合征
　　 多种因素参与ATRA导致的细胞组织浸润过程,但ATRA导致的细胞粘附增加,是引起分化综合征早期细胞出血管浸润组织的关键。ATRA诱导APL细胞分化过程中,分化的APL细胞表面表达大量与细胞粘附相关的分子,使得APL细胞易穿越血管而浸润肺,结果导致超炎反应的发生。因此,我们猜想雷公藤红素对DS的抑制作用,可能与其对细胞粘附分子的表达抑制有关。为了验证该猜想,我们通过体内外实验,观察了雷公藤红素对ATRA诱导白血病细胞表达粘附相关分子的影响。
　　 我们首先利用DS动物模型,并应用流式细胞术,研究雷公藤红素对DS外周血中白血病细胞粘附分子表达的影响。结果发现,DS小鼠外周血中的NB4细胞,其表面的粘附分子ICAM-1的表达增加,而用雷公藤红素处理之后,这些粘附分子的表达受到抑制。这些结果提示,雷公藤红素抑制ATRA诱导的肺浸润,可能与其抑制ATRA导致的细胞粘附有关。为了进一步揭示雷公藤红素抑制ATRA诱导的肺浸润的机制,我们用NB4细胞为细胞模型进行了探索。结果发现,ATRA诱导之后,NB4细胞表面CD11a、CD11b、CD11c、CD49d等粘附分子的表达也同时发生上调,但雷公藤红素处理后,这些粘附分子的增加没有受到抑制;对白细胞穿越血管发挥重要作用的VCAM-1和E-selectin不被ATRA诱导表达,雷公藤红素对其的表达也没有影响;但是,在DS早期中起重要作用的ICAM-1,其表达可被ATRA显著诱导,而这种诱导可被雷公藤红素显著抑制。
　　 ATRA导致的白血病细胞分泌的炎性因子和趋化因子,也是DS发生的重要分子基础,雷公藤红素对这些因子是否也有影响呢？因此,我们进一步检测了雷公藤红素对ATRA诱导NB4细胞分泌炎性因子和趋化因子的影响。结果显示,ATRA诱导后,NB4细胞中炎性因子IL-1β和TNF-α、趋化因子MCP-1和IL-8的分泌明显增加,雷公藤红素处理后,MCP-1和IL-8的分泌并未受到影响,而IL-1β和TNF-α的分泌则明显受到抑制。
　　 以上结果表明,在体内,雷公藤红素能抑制DS外周血中白血病细胞粘附分子的表达;在体外,雷公藤红素能明显抑制ATRA诱导的NB4细胞表达ICAM-1、抑制ATRA诱导NB4细胞分泌IL-β和TNF-α,但不能抑制ATRA诱导NB4细胞分泌MCP-1和IL-8。这些研究结果提示,雷公藤红素对ATRA诱导细胞肺浸润的抑制作用与其抑制ATRA诱导的ICAM-1表达增加有关。
　　 三、雷公藤红素通过MEK-ERK抑制反式维甲酸诱导的ICAM-1的表达
　　 多项研究表明,ICAM-1的表达增加是DS发生的重要分子因素之一。我们前面的结果表明,雷公藤红素抑制ATRA诱导的肺浸润,与其抑制ATRA诱导白血病细胞表达ICAM-1有关。但是,雷公藤红素是通过什么途径抑制ATRA诱导的ICAM-1呢？本研究部分采用小分子抑制剂结合Western方法,对目前已知的能调控ICAM-1诱导性表达的相关信号通路进行筛选,以明确雷公藤红素抑制ATRA诱导NB4细胞表达ICAM-1的机制。
　　 我们和其他研究组均发现,雷公藤红素是一种新型HSP90抑制剂。而HSP90能通过其结合的IKK,影响NF-kB的活性,从而调控ICAM-1的表达。因此,我们首先观察在NB4细胞中,雷公藤红素抑制ICAM-1的表达,是否与HSP90有关。我们用HSP90抑制剂17-AAG处理NB4细胞,结果发现,17-AAG的处理不但没有抑制作用,反而能协同ATRA刺激NB4细胞表达ICAM-1。NF-κB是调控ICAM-1诱导性表达的重要转录因子,而雷公藤红素在多种细胞模型中显示出对NF-κB强烈的抑制作用。因此,我们接着观察了ATRA对NF-κB的活化作用及雷公藤红素对该作用的影响。结果发现,ATRA能活化NB4细胞的NF-κB(p65),而雷公藤红素对ATRA活化NF-κB有明显的抑制作用。但是,用NF-κB抑制剂BAY11-7802和PDTC,并不能抑制ATRA导致的ICAM-1诱导性表达。此研究表明,雷公藤红素对ATRA诱导的ICAM-1表达的抑制与NF-κB通路没有直接关联。ICAM-1的诱导性表达也受JAK/STAT信号通路中的STAT1调控,而有文献报道ATRA能活化NB4细胞中的STAT1。因此,我们也对此进行了验证。结果显示,ATRA能活化NB4细胞中的STAT1,且雷公藤红素对该活化有抑制作用,但是,用STAT1抑制剂AG490,也同样不能抑制ATRA导致的ICAM-1诱导性表达。
　　 MAPK信号通路也是调控ICAM-1诱导性表达的一个重要通路。文献报道,ATRA对NB4细胞的MAPK信号通路的关键蛋白P38和ERK有活化作用。因此,我们首先检测了ATRA对P38、JNK和ERK的活化情况,结果发现,ATRA诱导能引起p-P38和p-ERK的表达明显上调,而p-JNK的表达无明显变化,而雷公藤红素处理后,P38的活化不受影响,而ERK的活化受到抑制。那么,雷公藤红素是否通过抑制ERK的活化,发挥其对ATRA诱导的ICAM-1表达的抑制作用呢？我们进一步用ERK抑制剂PD98059,对NB4细胞进行预处理后,再用ATRA进行刺激。结果发现,ERK抑制剂PD98059能抑制ATRA导致的ICAM-1表达增加。以上结果表明,红素对ATRA诱导的ICAM-1表达的抑制作用与其对ERK的磷酸化抑制有关。那么,雷公藤红素是如何影响ERK的活化呢？有文献报道雷公藤红素能与ERK直接结合。在本部分研究中,我们也对雷公藤红素与ERK的结合进行计算机预测,发现雷公藤红素的C6与ERK的C164-SH能形成化学键。另外,ERK的活化也受上游蛋白MEK的调控。因此,为了证实雷公藤红素是否是直接通过抑制ERK,影响ATRA诱导的ICAM-1的表达,我们观察了ATRA对ERK的上游蛋白MEK的作用及雷公藤红素的影响。结果发现,ATRA刺激NB4细胞15 min,就能诱导MEK发生磷酸化,60 min MEK的磷酸化水平达到高峰,而雷公藤红素处理能明显抑制ATRA导致的NB4细胞MEK的磷酸化。同样,用MEK抑制剂U0126进行处理后,ATRA诱导的NB4细胞表达ICAM-1增加也受到了抑制。
　　 综上所述,雷公藤红素不会影响ATRA诱导细胞分化效果,但能抑制ATRA治疗所诱导的致命副作用-分化综合征;雷公藤红素体内外抑制ATRA诱导的NB4细胞表达ICAM-1、体外抑制ATRA诱导的炎性因子IL-1β和TNF-α的释放;雷公藤红素通过MEK-ERK信号通路,抑制ATRA诱导的NB4细胞表达ICAM-1增加。该研究结果可为雷公藤红素在临床的应用提供实验基础,也为分化综合征的治疗提供了新的作用靶点

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

第一部分 雷公藤红素对反式维甲酸引起的分化综合征的抑制作用

一、引言

二、材料与方法

三、实验结果

四、讨论

第二部分 雷公藤红素对反式维甲酸诱导的ICAM-1表达的抑制作用

一、引言

二、材料与方法

三、实验结果

四、讨论

第三部分 雷公藤红素通过调控MEK-ERK信号途径对ATRA诱导ICAM-1表达的抑制作用

一、引言

二、材料与方法

三、实验结果

3、讨论

全文总结

参考文献

分化综合征研究进展

雷公藤红素抗炎药理研究进展

在读期间发表论文和参加科研工作情况说明

致谢