H19通过干扰hnRNPU-actin复合物抑制RNA聚合酶介导的转录

摘要

H19作为最早被发现和研究的少数几个长链非编码RNA分子之一，大量的研究提示H19与肿瘤的发生密切相关。然而H19的具体生物学功能及调控机制，尤其是对转录过程是否存在调节作用尚不清楚。因此探讨H19可能的生物学功能及其具体作用的分子机制可以为H19在生理及病理环境中的重要作用提供线索，带着这些问题我们展开了本课题的研究。
　　 首先，我们进行了RNA pulldown实验，将H19全长及其反义链构建到pSPT19载体上，体外转录获得H19正义链和反义链RNA后，检测浓度符合要求后冷冻保存。另外，收集肝癌细胞Hep3B和Huh-7的全蛋白待用。利用准备好的上述样品进行最终的RNA pulldown实验，对比正义链和反义链的差异蛋白条带做质谱鉴定后，结果显示H19的相互作用蛋白为核不均一核糖核蛋白(heterogeneous ribonucleopro-tein)hnRNPU。对质谱鉴定的结果通过Western blotting、RIP验证。在两者的结合确定后，为了进一步探明H19的哪个区域与hnRNP U结合，我们H19构建了H19不同区域截短体，通过截短体实验证明与hnRNPU结合的区域位于H19的5'端882nt。
　　 在确定与H19相互作用的蛋白为hnRNPU后，接下来我们便从hnRNP U这个RNA/DNA结合蛋白切入，探索H19的生理、病理学功能及其作用机制。在查阅相关文献后发现，hnRNP U能与不同的转录因子结合发挥不同的功能。而更加值得关注的是hnRNPU在RNA聚合酶Ⅱ介导的转录中也发挥重要的功能。研究报道，hnRNPU和actin结合通过促进RNA聚合酶Ⅱ CTD的磷酸化进而促进RNA聚合酶Ⅱ的转录。基于以上的研究结果的提示，我们首先想证实H19对RNA聚合酶Ⅱ介导的转录是否有调控作用。在Hep3B和Huh-7细胞中进行了EU掺入实验，实验结果表明相对于对照组过表达H19组EU掺入减少，以上结果提示H19抑制了RNA聚合酶Ⅱ介导的转录。
　　 在得出以上实验结果后新的问题需要我们去证实:H19通过怎样的机制抑制RNA聚合酶Ⅱ介导的转录，H19是否会对hnRNP U-actin复合物有影响。我们利用IP实验对以上假设进行检验，在Hep3B和Huh-7细胞中过表达H19，随着H19浓度的升高hnRNPU和actin的结合呈下降趋势。以上结果说明H19干扰了hnRNP U-actin复合物。那么H19对RNA聚合酶Ⅱ CTD的磷酸化过程是否有调控作用，因此我们分别用RNA聚合酶Ⅱ CTD2位、5位丝氨酸磷酸化及RNA聚合酶Ⅱ总CTD的抗体，相对于对照检测过表达H19对这几种形式蛋白的影响，Western blotting的结果显示H19抑制RNA聚合酶Ⅱ CTD的5位丝氨酸的磷酸化。而在过表达hnRNPU的基础上同时过表达H19时，以上的生物学效应明显减弱，这说明H19的以上生物学功能是依赖hnRNPU实现的。
　　 综上所述，本课题研究对H19在肝癌细胞的生物学功能进行了检测，探讨了H19与hnRNPU的结合及其在肝癌细胞中的抑制RNA聚合酶Ⅱ转录的作用，进一步完善了H19在肝癌细胞中的功能及其作用的机制研究，可能为H19的进一步研究提供线索和依据。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

材料和方法

一、实验试剂

二、主要材料

三、实验方法

结果

一、H19的相互作用蛋白为hnRNP U

二、H19的5’端882 nt对与hnRNP U的结合是必需的

三、肝癌细胞中H19抑制RNA聚合酶Ⅱ介导的转录

四、H19干扰hnRNP U-actin的结合

五、H19抑制RNA聚合酶Ⅱ CTD 5位丝氨酸的磷酸化

六、H19下调部分RNA聚合酶Ⅱ转录基因表达水平

七、hnRNP U对于H19介导的转录抑制是必需的

讨论

附录

综述

参考文献

在读期间发表论文和参加科研工作情况说明

致谢