基于微针给药主动靶向APCs的脂质体经皮疫苗递送系统研究

摘要

目前的疫苗接种方式主要为皮下或肌肉注射，存在顺应性差、免疫效率低、易产生耐受等问题，因此顺应性更好、更方便、高效的新型疫苗接种方法和递送系统研究一直是免疫学和药剂学研究的热点。经皮免疫(Transcutaneous immunization，TCI)是近年发展起来的一种新型免疫接种策略，它是将抗原和佐剂局部应用于皮肤而诱导产生全身免疫反应的新方法，可以克服目前注射接种方式存在的缺陷，有着广阔的应用前景。目前限制其应用的主要障碍是皮肤表层角质层的屏障作用，使疫苗的大分子抗原物质难以通过皮肤表层而进入富含抗原提呈细胞(Antigen-presenting cells，APCs)的活性表皮层和真皮层。微针(Microneedles)是指通过微电子机械工艺技术(MEMS)制作的，尺寸在微米级，长度100μm以上呈针状的复杂结构，材料可以为硅、聚合物、金属等。微针作为药物传输系统可有效克服角质层的屏障作用，同时具有精确、无痛、高效、便利的优点，已成为大分子抗原分子的透皮递送的最有效手段。
　　 在皮肤活性表皮层和真皮层内分布着大量抗原提呈细胞，主要是树突状细胞(Dendritic cells，DCs)及其未成熟亚型郎格汉氏细胞(Langerhans cells，LCs)，它们均可有效的摄取、处理和提呈外来抗原，并在迁移到引流淋巴结后有效激发抗原特异性的细胞和体液免疫应答。因此活性表皮层和真皮层被认为是疫苗接种的最佳部位之一。利用微针给药系统将抗原递送到活性表皮层和真皮层，由其中的抗原提呈细胞捕获处理抗原，发挥抗原提呈作用，可激发有效的全身免疫应答。
　　 本研究以鸡卵清白蛋白（Ovalbumin，OVA）为模型抗原，成功构建了可主动靶向DCs的免疫脂质体疫苗递送系统，结合微针透皮给药机制和促进大分子抗原透皮效果研究，开展其作为经皮主动靶向疫苗递送系统体内外特异性靶向DCs能力及机制、免疫脂质体对DCs功能影响及其机制、经皮免疫效果及机制等研究，分析其免疫应答的特点，初步阐明其免疫应答的机制和途径。
　　 第一部分中我们采用薄膜分散法成功的制备出了包载OVA抗原的脂质体，再利用巯基化试剂将抗DCs表面特异性CD11c分子的单克隆抗体巯基化，使其与脂质体膜材中的马来酰亚胺基团反应共价连接于脂质体表面，成功的制备纯化了包载OVA抗原主动靶向DCs的免疫脂质体，实验中同时制备了异硫氰酸荧光素标记的OVA蛋白双荧光标记免疫脂质体用于后续靶向性和抗原摄取实验研究。对制备得到免疫脂质体的粒径、形貌、包封率、Zeta电位等进行了表征，测定了单克隆抗体与脂质体的连接率和免疫脂质体表面连接单抗的DCs结合活性。结果表明脂质体表面光滑，粒径分布均匀，平均粒径在145-160nm范围，与未结合单克隆抗体的脂质体相比较，靶向免疫脂质体的平均粒径稍有增大，Zeta电位变化较小，测定得到CD11c单克隆抗体与脂质体连接率为（77.6±3.2）％，流式细胞术检测证明了CD11c单克隆抗体连接到脂质体表面后，仍然保持了与CD11c分子的特异结合活性，激光共聚焦实验也证明了DCs靶向免疫脂质体的成功制备。
　　 第二部分探讨了微针作用促进大分子抗原载体透皮作用的效果与机制。研究发现微针处理可大大提高免疫脂质体及其包裹大分子抗原的经皮透过量和皮肤滞留量，表明微针透皮给药方法具有较好的经皮促渗效果。激光共聚焦显微镜对微针处理皮肤后双荧光标记免疫脂质体透皮效果的观察表明，免疫脂质体及其包裹大分子抗原可通过微针阵列在皮肤表面穿刺出的微孔通道进入皮肤内，并可在皮肤近200μm深度观察到显著的荧光，说明免疫脂质体及其包裹的抗原蛋白可有效的被递送进入皮肤表皮层和真皮层上部。而实验中也观察到皮肤毛囊也可作为免疫脂质体及包载抗原进入皮肤的通道。通过台盼蓝染色、HE染色和扫描电镜等方法直观、清晰的表征了使用的金属微针阵列穿刺后皮肤的角质层和真皮层的药物传输通道的形成和微观物理形态改变，印证了微针阵列促进药物透皮的机制。还利用经皮水份流失TEWL测定说明了微针阵列穿刺后表皮透过能力的变化，发现无论是小鼠或人体皮肤，微针处理均可明显增加其TEWL值，表明微针穿刺一定程度破坏了皮肤的表面结构，增加了皮肤的通透性。但同时微针穿刺的皮肤刺激反应评价的结果也说明微针透皮具有较好的使用安全性。
　　 第三部分中我们采用流式细胞术和激光共聚焦显微镜观察的方法证明了制备的DCs靶向免疫脂质体体外对DCs具有特异靶向性。同时该主动靶向的免疫脂质体可有效促进DCs表型的成熟，使细胞表面Iab、CD40、CD80、CD86等表面分子的表达提高。同时免疫脂质体还可有效促进DCs对抗原的摄取和吞噬，并刺激DCs分泌功能性细胞因子TNF-α，说明免疫脂质体可有效促进DCs的功能成熟，有利于其免疫提呈功能的发挥。研究结果还表明DCs靶向免疫脂质体促进抗原摄取的机制是免疫脂质体的单克隆抗体与其配体的特异性结合。同时在体实验中观察到DCs可将摄取的免疫脂质体及其包载抗原有效的递送至引流淋巴结和脾脏等次级淋巴器官。
　　 第四部分我们以表面特异表达OVA抗原的EG7-OVA肿瘤细胞为模型，通过免疫后小鼠的荷瘤实验，观察了微针作用后DCs靶向免疫脂质体经皮免疫组小鼠的肿瘤生长情况和存活率，结果表明，与阴性对照组相比，DCs靶向免疫脂质体经皮免疫组小鼠的肿瘤生长较缓慢，生存期明显延长。对小鼠体内OVA特异性抗体的产生的测定表明，DCs靶向免疫脂质体经皮免疫有效激发了小鼠体内抗原特异性的体液免疫应答。更有意义的是，研究中发现该免疫脂质体微针经皮免疫在小鼠体内产生了更高的IgG1/IgG2a抗体滴度比，说明该免疫方法激发的免疫应答是Th1偏向的，更有利于细胞免疫的产生。通过进一步检测DCs靶向免疫脂质体经皮免疫在小鼠体内激发细胞免疫的情况，发现该免疫脂质体抗原载体系统微针经皮免疫后，可以强烈活化抗原特异性的T细胞，诱导Th1型细胞因子IFN-γ的产生，产生OVA抗原特异性的CTL，充分激发了细胞免疫应答。与之对应，霍乱毒素CT作为经皮佐剂或直接皮下注射免疫虽然同样可激发Th1型的应答，但其作用机制与DCs靶向免疫脂质体单独经皮免疫可能有一定的不同。
　　 本研究在微针给药系统基础上，利用单克隆抗体的主动靶向性，采用化学交联技术将针对DCs表面分子的单克隆抗体连接到脂质体表面形成主动靶向抗原提呈细胞的免疫脂质体，可有效的将免疫脂质体所包裹的大分子抗原特异高效地转运到树突状细胞，增加其对抗原分子的内吞、摄取和提呈，并激发了更有效的免疫应答。该研究结合了微针和免疫脂质体两种技术，发挥微针皮层定位和免疫脂质体特异细胞靶向的特性，实现微针到活性表皮层及单克隆抗体到抗原提呈细胞的二次定位，达到主动性的双重靶向功效，有望成为一种有效的免疫新方法，在抗病毒、抗肿瘤领域有较好的应用前景。

目录

声明

摘要

英文缩略词

前言

第一部分：载OVA抗原的DCs靶向免疫脂质体的制备及表征

1 仪器与材料

1．1 仪器

1．2 材料与试剂

1．3 细胞与动物

2 实验方法

2．1 载OVA抗原脂质体的制备及表征

2．2 CD11c单克隆抗体修饰的免疫脂质体的制备及表征

3 结果

3．1 免疫脂质体的Sepharose CL-4B层析柱纯化

3．2 制备的脂质体及免疫脂质体的外观、粒径及Zeta电位

3．3 APC标记的CD11c单抗标准曲线的绘制及脂质体连接率测定

3．4 FITC-OVA溶液标准曲线的绘制和免疫脂质体包封率的测定

3．5 免疫脂质体形貌的透射电镜观察

3．6 皮肤表面免疫脂质体染色后激光共聚焦观察

3．7 免疫脂质体表面连接的单克隆抗体DCs结合活性的测定

4 讨论

5 小结

第二部分：基于微针给药的免疫脂质体经皮促透效果及递送机理研究

1 仪器与材料

1．1 仪器

1．2 材料与试剂

1．3 细胞与动物

2 实验方法

2．1 离体皮肤的制备及预处理

2．2 微针穿刺实验方法

2．3 微针处理对免疫脂质体包载抗原的经皮促透作用

2．4 微针处理后透皮实验中皮肤内OVA抗原含量的测定

2．5 微针处理对免疫脂质体的皮内促透效果的激光共聚焦显微镜观察

2．6 微针对离体皮肤穿刺效果的形态观察

2．7 微针处理对皮肤透过功能的影响：经皮水份流失(TEWL)值的测定

2．8 微针穿刺对皮肤刺激反应评价

3 结果

3．1 微针阵列及进针装置

3．2 微针阵列处理对免疫脂质体包载OVA抗原的经皮促透作用

3．3 微针处理经皮促透作用的激光共聚焦显微镜观察

3．4 微针对离体皮肤穿刺效果的形态观察

3．5 微针穿刺后皮肤的透过功能评价

3．6 微针穿刺的皮肤刺激反应评价

4 讨论

5 小结

第三部分：免疫脂质体对DCs的主动靶向作用及对其功能的影响研究

1 仪器与材料

1．1 仪器

1．2 材料与试剂

1．3 细胞与动物

2 实验方法

2．1 小鼠骨髓来源的树突状细胞(BMDCs)的培养

2．2 小鼠耳部皮肤来源的树突状细胞(dDCs)的培养

2．3 免疫脂质体体外DCs靶向效率测定

2．4 免疫脂质体体外DCs靶向性的激光共聚焦显微镜观察

2．5 免疫脂质体对DCs表面成熟相关分子表达的影响

2．6 免疫脂质体刺激DCs分泌细胞因子TNF-α水平的检测

2．7 DCs抗原摄取功能实验

2．8 DCs对双荧光免疫脂质体摄取的动力学观察

2．9 免疫脂质体微针透皮给药

2．10 DCs摄取透皮抗原后向淋巴结和脾脏迁移情况观察

3 结果

3．1 免疫脂质体体外具有DCs特异靶向性

3．2 免疫脂质体体外DCs靶向性的激光共聚焦显微镜观察

3．3 免疫脂质体可促进DCs的表型成熟

3．4 免疫脂质体可促进DCs分泌前炎性细胞因子TNF-α

3．5 免疫脂质体可促进DCs对免疫脂质体包载抗原的摄取

3．6 DCs可将摄取的抗原有效转运至引流淋巴结和脾脏

4 讨论

5 小结

第四部分：载OVA免疫脂质体基于微针给药经皮免疫的体内效果评价

1 仪器与材料

1．1 仪器

1．2 材料与试剂

1．3 细胞与动物

2 实验方法

2．1 小鼠的免疫

2．2 免疫小鼠血清中OVA特异性抗体滴度的测定

2．3 小鼠荷瘤及观察

2．4 免疫小鼠脾细胞的制备

2．5 T细胞增殖实验

2．6 免疫小鼠脾细胞抗原再刺激分泌IL-2、IFN-γ水平的检测

2．7 CTL杀伤试验

3 结果

3．1 免疫脂质体经皮免疫对E．G7-OVA冲瘤生长的抑制作用

3．2 免疫脂质体经皮免疫延长了荷瘤小鼠的生存期

3．3 免疫脂质体经皮免疫产生了有效的体液免疫应答

3．4 免疫脂质体经皮免疫产生了OVA抗原特异性的T细胞增殖

3．5 免疫脂质体经皮免疫产生的免疫应答是Th1偏向的

3．6 免疫脂质体经皮免疫诱导小鼠产生了抗原特异性CTL

4 讨论

5 小结

全文总结

参考文献

综述

发表论文及参加的科研工作

致谢