黄连解毒汤对CLP诱导的脓毒症大鼠的保护作用及其代谢组学研究

摘要

研究目的: 脓毒症(Sepsis)是一种由感染引起的全身性的炎症反应综合征，主要由严重的创伤、烧伤、大手术和休克等引起，其发病急，病程进展迅速、病死率高，是目前医院重症监护病房病人的主要死亡原因之一。脓毒症的早期表现为全身的系统性炎症反应综合征（Systemicinflammatoryresponsesyndrome，SIRS），如未能得到及时、有效的治疗，可引起多器官功能障碍综合症(Multipleorgandysfunctionsyndrome，MODS)，MODS是脓毒症的后续阶段，一旦发生，其治疗难度很大，死亡率可达40％-60％。脓毒症的发病机制复杂，目前仍然没有完全阐明，一般认为，脓毒症的发生与炎症因子过度表达、免疫功能紊乱、凝血功能异常、肠道细菌或内毒素的移位以及基因多态性有关。目前仍然没有治疗脓毒症的有效药物。以往的研究证实单纯地阻断引起脓毒症发生机制中的某一个环节并不能显著地提高脓毒症患者的生存率，需要采用综合疗法在整体上对脓毒症患者进行全面的调理。中医中药在辩证论治的基础上对疾病进行整体上的全面的调理，采用中药对脓毒症进行整体的治疗可能是治疗脓毒症的有效手段。黄连解毒汤(Huang-Lian-Jie-Du-Tang，HLJDT)由黄连、黄芩、黄柏和栀子四味中药组成，具有清热、泻火、解毒的功效，而脓毒症属于温病、热症的范畴，恰属黄连解毒汤的适应症。因此，黄连解毒汤可能是治疗脓毒症的有效药物。 由于中药来源及其质量受地域及气候等的影响变化很大，质量不易控制，且中药中成分复杂，药理机制不明确，使其在国际社会的广泛应用受到极大限制，因此，应用中药有效成分组成的制剂代替成分复杂的中药提取物是当今中药研究及应用的一大趋势。HLJDT主要含有黄酮类、环烯醚萜苷类及生物碱类三大化学成分，本课题组前期对HLJDT的药效物质基础进行了血清药理学研究，利用液质联用技术从黄连解毒汤中鉴定到了13个主要成分，它们分别为:小檗碱、药根碱、巴马汀、木兰花碱、黄连碱、黄柏碱、栀子苷、黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、汉黄芩苷、藏红花素及绿原酸。本课题以这13种单体成分组成HLJDT物质组复方(ComponentgroupofHLJDT,HLJDT-CG)，在研究HLJDT对脓毒症的防治作用的同时，对HLJDT-CG的脓毒症防治作用也进行了对比研究。 代谢组学(Metabonomics)是继基因组学、转录组学和蛋白质组学之后新发展起来的一门组学技术，是系统生物学的重要组成部分。本课题将代谢组学技术应用于脓毒症的代谢研究，分析脓毒症大鼠以及药物治疗的脓毒症大鼠的代谢变化规律，以找出能早期、快速、有效诊断脓毒症疾病发生以及评价药物治疗效果的生物标志物，以这些代谢标志物的变化情况为标准，在早期采取积极措施就有可能改善脓毒症预后。 研究方法: 本研究采用盲肠结扎穿孔(cecalligationandpuncture，CLP)引起的脓毒症大鼠模型，于造模前2h分别通过灌胃的方式给予HLJDT及HLJDT-CG，通过观察生存率、肝和肺组织病理学的改变等评价HLJDT及HLJDT-CG的疗效，采用ELISA法测定血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、IL-17A等炎症因子的水平，采用RealTime-PCR的方法测定肝、肺和肾组织中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、IL-17A等炎症因子mRNA的表达情况，RealTime-PCR法测定脾组织中Th1型的细胞因子IFN-γ、Th2型细胞因子IL-4、Th17型细胞因子IL-17A及其转录因子ROR-γt的mRNA的表达水平，琼脂糖培养基培养大鼠腹腔渗出液及肝和肺组织匀浆液中的细菌并计算菌落数，全自动血液凝固仪测定TT、PT及APTT等凝血指标，采用荧光微球-流式细胞技术测定大鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力，通过上述研究，从抗炎、免疫调节、抗凝血、抗菌及抑制细菌移位和增强巨噬细胞吞噬能力等多个途径探讨黄连解毒汤防治脓毒症的作用环节。本研究还运用代谢组学的方法，采用快速液相色谱串联四级杆飞行时间质谱方法（RHPLC-Q-TOF-MS）对假手术组大鼠、脓毒症组大鼠和给药组大鼠在2h、10h及24h的血清进行代谢组学研究，采用PLS-DA法进行判别分析，通过分析脓毒症在2h、10h和24h的代谢组变化情况，寻找可以作为早期诊断脓毒症疾病发生的生物标志物，并且从代谢组学的角度观察黄连解毒汤对脓毒症的防治效应，寻找可以评价HLJDT早期药物疗效的生物标志物。 实验结果: 1、HLJDT及HLJDT-CG均可显著提高脓毒症大鼠的生存率，且二者提高脓毒症大鼠生存率的作用相当，其中HLJDT的最佳给药剂量为270mg/kg，HLJDT-CG的最佳给药剂量为12.5mg/kg。 2、HLJDT及HLJDT-CG均可显著改善脓毒症大鼠肝和肺组织病理学的改变，显著降低脓毒症大鼠血清内ALT和AST的水平，说明HLJDT及HLJDT-CG对脓毒症大鼠具有显著地保护作用。 3、HLJDT及HLJDT-CG均可显著降低脓毒症大鼠血清内促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-17A的含量，显著降低这些促炎因子在肝、肺、肾组织内的mRNA的表达水平，而对血清和组织内抗炎因子IL-10的升高无显著影响;HLJDT及HLJDT-CG均可显著逆转Th1型细胞因子IFN-γ的mRNA表达量的降低和Th2型细胞因子IL-4的mRNA的表达量的升高，逆转脓毒症引起的Th1型细胞免疫向Th2型细胞免疫的偏移;显著降低Th17型细胞因子IL-17A及其转录因子ROR-γt的mRNA的表达水平;HLJDT及HLJDT-CG均可显著降低脓毒症大鼠腹腔液及肝、肺组织匀浆液内细菌的菌落数，说明HLJDT及HLJDT-CG均可显著降低腹腔内的细菌菌的数量，并显著抑制腹腔内的细菌向肝和肺等组织的转移;HLJDT及HLJDT-CG均可显著升高凝血指标PT以及TT的水平，说明HLJDT及HLJDT-CG可显著延长脓毒症大鼠的凝血时间;HLJDT及HLJDT-CG均可显著升高脓毒症大鼠腹腔巨噬细胞的吞噬百分比和吞噬指数，说明HLJDT及HLJDT-CG可显著提高大鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力。 4、代谢组学研究显示，脓毒症大鼠在造模后2h、10h和24h均发生了显著地代谢组表达变化，对造模后2h在假手术组和模型组之间有显著性差异的代谢物进行鉴定，得出17个脓毒症早期诊断生物标志物，分别为L-脯氨酸（L-Proline）、L-缬氨酸(L-Valine)、马尿酸(Hippuricacid)、吲哚(Indole)、4-甲酰基吲哚(4-FormylIndole)、花生酸(Arachidicacid)、花生四烯酸(ArachidonicAcid，AA)、白三烯F4(LeukotrieneF4，LTF4)、二十二碳六烯酸（DocosahexaenoicAcid，DHA）、二十碳五烯酸(EicosapntemacniocAcid，EPA)、前列腺素E3(ProstaglandinE3，PGE3)、油酸(Oleicacid)、肉碱（Carnitine）、棕榈酰肉碱(Palmitoylcarnitine)、溶血卵磷脂(Lysophosphatidylcholine，LysoPC)、磷脂酰胆碱(Phosphatidylcholine，PC)和嘌呤（Purine）;HLJDT给药在2h和10h可以显著逆转脓毒症引起的代谢组变化，对造模后2h在给药组和模型组之间有显著性差异的代谢物进行鉴定，得出了10个可早期评估HLJDT药效的生物标志物，分别为L-脯氨酸(L-Proline)、L-缬氨酸(L-Valine)、花生酸(Arachidicacid)、花生四烯酸(ArachidonicAcid，AA)、二十二碳六烯酸(DocosahexaenoicAcid，DHA)、二十碳五烯酸(EicosapntemacniocAcid，EPA)，前列腺素E3(ProstaglandinE3，PGE3)、油酸(Oleicacid)、肉碱(Carnitine)以及棕榈酰肉碱（Palmitoylcarnitine）;另外，为了对脓毒症代谢的变化和HLJDT的药效进行整体观察和评估，我们还对造模后10h和24h在各组间有显著性差异的代谢物进行鉴定，得出了造模后10h在假手术组和模型组之间有显著性差异的生物标志物21个，造模后24h在假手术组和模型组之间有显著性差异的生物标志物有23个，HLJDT可以调节的生物标志物共12个。对这些生物标志物进行生物学分析，通过检索代谢组学相关数据库及查阅相关文献，我们构建了脓毒症相关的代谢网络，提示脓毒症主要引起氨基酸代谢、ω-3型不饱和脂肪酸的代谢、ω-6型不饱和脂肪酸代谢、嘌呤代谢、脂类代谢等代谢通路的异常，这些代谢途径与能量消耗、炎症反应、氧化应激等密切相关，其中与炎症反应相关的ω-3型不饱和脂肪酸及ω-6型不饱和脂肪酸的代谢可能是HLJDT对脓毒症起防治作用的一个非常重要的代谢通路。 结论: HLJDT及HLJDT-CG对CLP诱导的脓毒症大鼠有显著地保护作用，HLJDT及HLJDT-CG对脓毒症大鼠的保护作用可能与其抗炎、抗凝血、抑菌及抑制细菌移位、调节免疫以及增强巨噬细胞吞噬能力等有关; 代谢组学研究初步确定脓毒症早期诊断的生物标志物有17个，黄连解毒汤早期药效评估的生物标志物有10个。脓毒症的代谢紊乱主要涉及氨基酸代谢、ω-3型不饱和脂肪酸的代谢、ω-6型不饱和脂肪酸代谢、嘌呤代谢和脂类代谢等，HLJDT对多个生物标志物均有显著调节作用，其中与炎症反应相关的ω-3型不饱和脂肪酸及ω-6型不饱和脂肪酸的代谢可能是HLJDT对脓毒症起防治作用的一个非常重要的相关代谢通路。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一章 前言

一、脓毒症简介

二、脓毒症的临床治疗

三、中药治疗脓毒症进展

四、脓毒症动物模型

五、黄连解毒汤治疗脓毒症的前景

第二章 HLJDT及HLJDT-CG对CLP诱导的脓毒症大鼠的保护作用研究

一、引言

二、黄连解毒汤冻干粉的制备

三、HLJDT对CLP诱导的脓毒症大鼠死亡率的影响

四、HLJDT-CG对CLP诱导的脓毒症大鼠死亡率的影响

五、HLJDT及HLJDT-CG对CLP诱导的脓毒症大鼠的保护作用比较及对大鼠肝肾功能的影响

第三章 HLJDT及HLJDT-CG对CLP诱导的脓毒症大鼠保护作用的作用环节研究

一、引言

二、HLJDT及HLJDT-CG对脓毒症大鼠保护作用的作用环节研究

(一)材料

(二)方法

(三)结果

(四)结论

第四章 黄连解毒汤对CLP诱导的脓毒症大鼠保护作用的代谢组学研究

一、引言

二、实验材料

(一)实验动物

(二)试剂及仪器

三、实验方法

(一)实验分组及给药

(二)CLP模型的制备

(三)标本采集

(四)样品预处理

(五)分析条件的优化和方法学考察

(六)数据处理和分析

(七)生物标志物的鉴定

四、实验结果

(一)方法学考察和分析条件的优化

(二)代谢组学研究结果

五、讨论

六、结论

总结

参考文献

文献综述 脓毒症的病理生理学变化及研究进展

攻读博士学位期间已发表及待发表的论文

致谢