非编码RNA参与的表现遗传调控在肝癌侵袭--转移级联反应中的作用研究

摘要

原发性肝癌是世界范围内最常见且死亡率最高的恶性肿瘤之一，多发于东南亚及非洲，而在我国尤甚。原发性肝癌中绝大多数为肝细胞癌。虽然在过去的几十年中肝癌的诊断与治疗取得了很大的进步，但是肝癌患者的5年生存率仍低。肝癌患者较差的预后主要是由于肝内及肝外转移。目前人们对肝癌发生、发展，特别是肝癌转移的具体分子机制并不十分清楚。既往研究多关注肝癌中遗传学上的基因突变，特别是编码蛋白基因的突变、功能及其参与的信号通路调控。但是目前研究同时也表明单纯的基因组DNA的改变并不能解释肝癌发生发展过程的复杂性。同一基因的不同表达水平，也就是基因表达调控在肝癌中的作用正逐渐被揭示。而其中表观遗传学调控方式，包括DNA甲基化、组蛋白修饰、非编码RNA等的调控，在肝癌的发生发展过程中起着重要的作用，同时也越来越受到研究者的重视。组蛋白乙酰化修饰可促进基因的表达，而组蛋白去乙酰化修饰可抑制基因的表达。功能性非编码RNA，包括长链非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNA)和小RNA(microRNA)，在基因表达调控中也发挥着重要的作用。 本研究中我们利用表达谱芯片、lncRNAs芯片、深度测序、生物信息学分析、经典分子生物学技术等，在分子水平、细胞水平、实验动物水平及临床样本中研究了非编码RNA参与的表观遗传调控对肝癌肿瘤生物学行为的影响，获得了如下结果: 我们发现相对于癌旁组织，miR-200a的表达及其启动子区域组蛋白H3乙酰化水平在肝癌组织中下调。通过生物信息学分析结合已发表文献，我们发现组蛋白去乙酰化酶4(HDAC4)可被转录因子Sp1招募至miR-200a的启动子区域，减少miR-200a启动子区域组蛋白H3乙酰化水平，进而抑制miR-200a的启动子活性及其表达。通过生物信息学预测，我们还发现HDAC4可能是miR-200a的靶基因。随后我们通过双荧光素酶报告基因检测及蛋白免疫印迹等证明miR-200a可直接靶向HDAC4mRNA的3'UTR区域，抑制HDAC4的表达。表明miR-200a和HDAC4之间存在相互抑制的反馈作用环路。并且在临床样本中我们还发现相对于癌旁组织，HDAC4的表达在肝癌组织中上调;miR-200a的表达及miR-200a启动子区域组蛋白H3乙酰化水平皆和HDAC4的表达成负相关。通过靶向抑制HDAC4，miR-200a可反过来上调自身启动子区域的组蛋白H3乙酰化水平，诱导自身的转录。通过靶向抑制HDAC4，miR-200a还可诱导总组蛋白H3乙酰化水平的上调，增加p21WAF/Cip1启动子区域组蛋白H3乙酰化水平。在该部分的研究中我们鉴定出肝癌中HDAC4/Sp1/miR-200a调控网络可诱导miR-200a的下调、HDAC4的上调及异常的组蛋白乙酰化。该调控网络的鉴定为肝癌的药物治疗提供新的靶点。 肝癌的高复发率及较差的预后主要是由于肝内及肝外转移。虽然已有许多研究表明编码蛋白的基因可对肿瘤转移起着重要的调控作用，但是随着非编码RNA的调控作用逐渐被揭示，其对转移的作用不容小觑。有文献报道TGF-β通过诱导上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)促进肿瘤的转移，也有研究发现一些lncRNAs可调控肿瘤的转移，但是TGF-β对lncRNAs的调控作用及是否有lncRNA介导了TGF-β的促转移作用尚不清楚。因此我们利用lncRNAs芯片筛选了受TGF-β调控的lncRNAs。近年来有研究表明一些长链RNA分子，包括lncRNA及mRNA，可特异性地吸附microRNAs，而解除microRNAs对其真正下游靶基因的抑制作用。既往研究表明miR-200家族通过特异性的靶向ZEB1/2上调E-cadherin，抑制EMT。因此我们对受TGF-β调控的lncRNAs进行生物信息学分析，寻找可能吸附miR-200家族而诱导EMT的lncRNAs。通过lncRNAs芯片结合生物信息学分析，我们发现lncRNA-ATB既可被TGF-β活化，又含有三个预测的miR-200家族结合位点。随后我们利用RNA免疫共沉淀、体外转录生物素标记的lncRNA-ATB、双荧光素酶报告基因检测等证明lncRNA-ATB确实是miR-200家族的靶基因，并且lncRNA-ATB可特异性吸附miR-200家族。接着我们利用定量PCR、蛋白免疫印迹、双荧光素酶报告基因检测、免疫荧光等，都发现在不同细胞系中lncRNA-ATB皆可上调ZEB1/2，诱导EMT。在临床肝癌组织样本中我们也发现lncRNA-ATB的表达和ZEB1/2成正相关，和E-cadherin成负相关，支持lncRNA-ATB对ZEB1/2及EMT的调控作用。体外实验还发现lncRNA-ATB促进肝癌细胞的侵袭。lncRNA-ATB对ZEB1/2、EMT及肝癌细胞侵袭的作用依赖于其对miR-200家族的竞争性结合。进一步分析临床样本，我们发现相对于癌旁组织，lncRNA-ATB在肝癌组织中表达上调，在门静脉癌栓中进一步上调;并且lncRNA-ATB的表达和病人的肝癌侵袭特征成正相关，和病人预后成负相关。支持lncRNA-ATB对肝癌转移的促进作用。 利用裸鼠肝脏原位荷瘤模型，我们发现lncRNA-ATB促进肝癌细胞的体内转移，但是该作用并不完全依赖于miR-200家族。进一步将体内转移细分为早期的侵袭入血和远端定植，并利用裸鼠肝脏原位荷瘤模型-流式细胞仪检测循环血肿瘤细胞、尾静脉注射肺定植模型、脾脏注射肝定植模型，发现lncRNA-ATB既可促进肝癌细胞的体内侵袭入血，该作用完全依赖于miR-200家族;lncRNA-ATB又可促进肝癌细胞于远端转移灶定植，该作用不依赖于miR-200家族。然后我们利用表达谱芯片联合RNA免疫共沉淀-深度测序，发现lncRNA-ATB还可吸附IL11 mRNA，上调IL11的表达，诱导IL11的自分泌，活化IL11/STAT3信号通路。接着我们利用体内外实验证实了lncRNA-ATB对IL11/STAT3的作用及lncRNA-ATB促定植的作用依赖于IL11。 该部分的研究表明lncRNA-ATB可促进肝癌细胞的侵袭-转移级联反应。证明lncRNAs在TGF-β信号通路及肝癌转移中发挥着重要作用。lncRNA-ATB可作为预示肝癌病人转移可能性的潜在靶标，及作为抗肝癌转移治疗的新的靶点。 总之，我们的研究对原发性肝癌发生发展，特别是转移过程中功能性非编码RNA参与的表观遗传调控的作用进行了深入而广泛的探讨，为进一步理解该过程中纷繁复杂的信号通路提供了新的思路和视角，为肝癌的预警及治疗提供了新的靶点。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一章 前言

第二章 肝癌中组蛋白去乙酰化酶4／转录因子Sp1／microRNA-200a调控网络诱导异常的组蛋白乙酰化

一、材料和方法

二、结果

三、讨论

第三章 被TGF-β活化的长链非编码RNA通过结合miR-200s及IL11 mRNA促进肝癌的侵袭-转移级联反应

一、材料和方法

二、结果

三、讨论

第四章 总结

参考文献

附录

文献综述 内源性竞争性RNA的调控作用

发表论文和参加科研工作情况说明

致谢