BDNF对大鼠脊髓运动神经元甘氨酸能神经传递的调控作用

摘要

背景:本课题组在腰骶神经损伤做了系统的研究。在马尾神经综合征的机制研究中，史建刚教授提出了马尾神经损害“双向馈变”学说，其中逆向馈变导致脊髓前角和后角神经元的损害。在周围神经研究中也发现，坐骨神经损害后继发性产生脊髓前角大量运动神经元的凋亡。目前大宗的脊柱外科伤患的患者中发现，神经根损害发生所支配肌肉功能障碍，即使神经减压术后，功能恢复也不理想，例如:大小便功能障碍等;神经根损害源性的脊髓前角运动神经元发生的损害，被脊柱外科和神经科医师所关注。为了进一步探索脊髓前角细胞的继发损害这一病理机制，寻求抑制该机制发生的方法，本课题主要通过BDNF对大鼠正常脊髓运动神经元甘氨酸能神经传递的调控作用机制的研究，了解BDNF对脊髓前角细胞的传导功能变化的影响，目的在于探讨神经元病理机制下BDNF对脊髓前角运动神经元的损害和功能障碍的修复机制。 研究现状:BDNF的作用包括促进对神经元生存、分化、突触的调控、少突胶质细胞再生促进髓鞘形成，诱导调节轴突和树突的生长等作用[1-8]。在马尾神经综合征治疗研究中，对周围神经的作用取得了一定的成果，然而有关BDNF在脊髓运动神经元，这一主要运动输出结构中所发挥的作用仍然知之甚少。Boyce等[9]通过行为、电生理和免疫组织化学结果发现，缓慢给予脑源性神经营养因子可以增强脊髓运动神经元的兴奋性，改善瘫痪老鼠下肢运动功能，但可能引起的并发症包括肌肉痉挛和痛觉敏感。通过推断，BDNF对脊髓运动神经元兴奋性有调控作用。运动神经元兴奋性的调控分为抑制性和兴奋性两种作用，两者共同作用，才使得运动协调、精准经行。闰绍细胞作为抑制性中间神经元，所发挥的回返性抑制作用起得十分重要作用，运动神经元兴奋的同时向闰绍细胞传递信号引起闰绍细胞释放甘氨酸神经递质，回返作用于原神经元产生抑制作用，及时终止该兴奋神经元的活动，确保协调、同步化进行。有文献报道[10]当发生突触后抑制时，BDNF可直接增强NMDA诱发的突触前兴奋。脑源性神经营养因子对脊髓闰绍细胞回返性抑制作用的影响，目前为止未有相关文献报道。为此，我将研究BDNF是否也能够参与了甘氨酸(glycine)神经递质对脊髓运动神经元兴奋性的抑制作用，由于课题有限，主要利用离体脑片全细胞膜片钳技术、辅助免疫组织化学等技术，初步研究BDNF是对脊髓运动神经元兴奋性的调控作用。与甘氨酸共同参与机制？协同作用和拮抗作用的规律？和TrKB受体介导的相互关系？ 实验目的： 本实验研究我们采用离体脊髓脑片的全细胞膜片钳技术、实时定量PCR以及免疫荧光组织化学双标记技术探讨BDNF对脊髓运动神经元电活动及其对glycine能神经传递的调控作用及受体参与情况。观察BDNF、甘氨酸诱发运动神经元的电流大小变化，以及受体参与情况。了解BDNF在脊髓中枢神经系统，尤其是脊髓前角运动神经元信号输出结构中的作用。 研究内容及方法: 1、取大鼠腰骶膨大部段脊髓制作脊髓脑片。采用出生后14-24天的SD大鼠。动物经深度地冰水冷冻麻醉后快速断头，剪刀剪除胸腰段锥板，逐层分离暴露并游离脊髓，剪断脊神经，取出脊髓快速放入预先准备的人工脑脊液，随后将腰段脊髓粘着于琼脂块，固定于振动切片机台上，启动切片机切取已处理好的脊髓冠状面脑片若干，并制作脊髓脑片。 2、脊髓运动神经元的鉴别和选取。从40只12-24天大鼠脊髓腰骶膨大段脑片的腹角获得了40个符合选取标准的脊髓前角运动神经元。通过形态学和电生理学的方法，从中鉴别和选取所需的运动神经元。 3、随机选取脊髓前角运动神经元分A、B、C、D四组，在不同的灌流试剂(BDNF、glycine)、灌流浓度、时间长短等条件下，电压钳制记录脊髓神经元在不同方式刺激情况下所诱发的外向电流大小，从而观察BDNF、glycine对神经元诱发外向电流时出现的相互关系。 4、随机分两组，阻断突触前神经元的动作电位发放（灌流含0.3μM TTX的人工脑脊液阻断快Na+通道引起的动作电位15分钟）、在这两种不干预条件下接受glycine刺激而产生的神经元抑制性反应，并记录不同组的细胞膜诱发电流的大小。以确定glycine是作用于突触前还是突触后。 5、分四组在不同的干预条件下，记录神经元所诱导的外向电流大小，观察BDNF、glycine、TrkB受体中的相互作用关系。 6、运用实时定量PCR和免疫荧光组织化学双标记技术观察了BDNF及其下游偶联的TrkB受体在大鼠腰骶膨大段脊髓运动神经元中的表达和分布情况。 结果: (1) BDNF对脊髓运动神经元的兴奋性（兴奋性或抑制性效应）并无直接作用; (2) BDNF能够剂量依赖地增强脊髓运动神经元上由glycine诱发的外向电流; (3) Glycine对脊髓运动神经元的抑制性效应是一个直接的突触后效应; (4) BDNF对脊髓运动神经元上glycine的抑制增强效应是通过激活其TrkB受体介导的; (5) BDNF及其受体TrkB在脊髓中均有大量表达。 结论: BDNF可以通过其突触后偶联的TrkB受体直接调控glycine能神经递质对脊髓运动神经元的作用。由于脊髓运动神经元主要接受来自闰绍细胞的glycine能投射，我们认为BDNF在闰绍细胞-运动神经元的信息整合中发挥重要功能，并进而影响运动神经元对高位运动中枢下行运动指令的反应敏感性，从而调节脊髓（运动神经元）所支配相应肌肉的运动功能。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

课题设计

一、脊髓运动神经元脑片的制备

二、运动神经元的鉴定选取

三、观察BDNF在甘氨酸能神经递质调控运动神经元过程中的作用

(一)评估BDNF、甘氨酸对神经元诱发外向电流时的电流变化

(二)评估glycine是抑制作用在于突触前还是突触后

(三)评估BDNF、glycine、TrkB受体在诱发运动神经元外向电流时的相互作用关系

实验材料与方法

一、实验材料

(一)实验动物

(二)实验所需的仪器设备

(三)实验所用的溶液和试剂

二、实验方法

(一)、脊髓脑片的制备

(二)电生理检测

(三)免疫荧光组织化学实验

(四)实时定量RT-PCR

(五)数据分析

实验结果

一、脊髓运动神经元的甄别

二、BDNF能够剂量依赖性地增大脊髓运动神经元上glycine诱发的外向电流

三、Glycine对脊髓运动神经元的抑制性作用是一个直接的突触后效应

四、BDNF对脊髓运动神经元上glycine能神经传递的增强效应是由TrkB受体介导的

五、BDNF及其受体TrkB在脊髓前角运动神经元中的表达

讨论

结论

参考文献

综述 脑源性神经营养因子与脊髓

论文发表和参加科研工作情况

致谢