HCV E2半胱氨酸突变对其结构和功能的影响及慢性丙肝患者体内中和抗体研究

摘要

HCV(HepatitisCvirus，HCV)是单正链RNA病毒，属于黄病毒科丙型肝炎病毒属，主要经血液传播，是引起病毒性肝炎的重要病原体。HCV感染的慢性率超过80％，远远高于HBV感染。HCV慢性感染可引起肝硬化和肝细胞癌，据报道病史20年以上的慢性丙型肝炎患者，肝硬化的年发生率为10-15％，而每年约有1-7％的肝硬化患者发展为肝癌。世界卫生组织2014年最新报告的全球丙型肝炎病毒感染人数为1.3-1.5亿人，每年因丙肝相关性肝病死亡人数为35-50万。我国国家疾病预防控制中心发布的数据显示，近几年我国每年新确诊的丙型肝炎患者正逐年增加:2010年153039人，2011年173872人，2012年201622人，2013年223094人(http://www.chinacdc.cn/tjsj/fdcrbbg)。据估计我国HCV感染者不低于4900万人。另外，十余年来我国一直有聚集性HCV感染的报道。 丙型肝炎病毒基因组于1989年被克隆，迄今已25年，在这25年里，对HCV的分子生物学、感染、免疫与致病机制等方面的认识有了巨大进展，这些进展产出的一个突出成就就是一些直接抗HCV药物(direct-actingantiviralagents，DAAs)的上市。近几年在欧美批准上市的口服抗HCV药物蛋白酶抑制剂(如Boceprevir和Telaprevir)及NS5B核苷酸聚合酶抑制剂（如Sofosbuvir）使得持续病毒学应答率从聚乙二醇干扰素联合利巴韦林经典疗法的40～50％增至70～90％，尤其是核苷酸聚合酶抑制剂的治疗不需要再联合干扰素。然而，这些药物在中国以及其他许多国家还没有获批上市，且疗效受基因型的限制，而费用又过于昂贵，如Sofosbuvir在美国的12周治疗费用高达8.4万美元。另外，病毒对蛋白酶抑制剂类药物的耐药性突变已有报道。 预防HCV感染的疫苗在欧美、日本等发达国家一直备受关注，已有十余种丙肝疫苗，包括预防性疫苗和治疗性疫苗进入了临床试验，但还没有一种疫苗上市。HCV基因组高度变异，被分为六个或七个不同的基因型及数十个不同亚型。与HIV相似，基因变异是HCV逃避宿主免疫的主要策略，也是预防性疫苗研究陷于困境的重要原因。虽然近年来DAAs取得了重要进展，并不断有新的DAAs在临床试验中显示出良好的治疗效果，但丙肝疫苗的研发仍然非常迫切。尤其对于一些高危人群，如执业医师、静脉吸毒者、与丙肝患者密切接触者、男同性恋者、职业献血员以及聚集性HCV感染地区人群等。 HCV包膜蛋白是诱导中和抗体的靶抗原，因而是预防性疫苗研发的关键抗原，但用HCV包膜蛋白疫苗免疫黑猩猩只能抵抗同株病毒的攻击，接种健康志愿者也只能诱导低水平交叉中和异株、异基因型病毒的抗体，该疫苗研发历经20年仍未能上市。HCV包膜蛋白由E1和E2两种多肽组成，二者形成异二聚体，共同介导HCV的细胞入侵。HCV包膜蛋白位于HCV多蛋白的第192-746位氨基酸残基（以1a型H77株为参考标准），其中E1位于aa192-383，共192个氨基酸残基;E2位于aa384-746，共363个氨基酸残基。E2包膜蛋白在HCV多蛋白中变异性最高，并且集中于几个特定的高变区，分别为HVR1(aa384-410)，HVR2(aa460-485)及igVR(aa570-580)。E2蛋白的aa384-715为胞外段，E2aa716-746为其跨膜区，E2蛋白aa384-661能与SR-BI和CD81结合，也被称为受体结合区(RBD)，aa662-715为茎区。 由分子内半胱氨酸残基形成的二硫键对于蛋白质功能性构象的形成和维持具有重要作用，HCV包膜蛋白E2胞外域含有18个半胱氨酸残基(cys429、cys452、cys459、cys486、cys494、cys503、cys508、cys552、cys564、cys569、cys581、cys585、cys597、cys607、cys620、cys644、cys652、cys677)，在7个基因型之间高度保守，提示二硫键对于E2结构和功能具有重要作用。我们于是试图确定特定位置半胱氨酸对E2蛋白的构象和功能的影响，从2011年开始了相关研究。McCaffrey等2012年报道半胱氨酸残基在HCVpp入侵宿主细胞的过程中具有重要作用，半胱氨酸残基突变影响HCVpp上E2蛋白和受体CD81结合及E1E2二聚体形成，这些与我们当时的研究结果相似。但HCVpp的包装本身可能就受半胱氨酸突变的影响，因此用HCVpp模型研究E2半胱氨酸的作用有其局限性。二硫键可能通过影响蛋白质的构象影响抗原表位的形成，Fenouillet等2008年报道用部分还原状态的E2蛋白免疫小鼠能够增强中和抗体的诱导，但确切影响抗原表位的二硫键还不明确。 目前已经明确针对HCV包膜蛋白的中和抗体在HCV感染急性期的病毒清除具有一定作用，然而对于大部分慢性感染者，中和抗体对HCV病毒血症水平的影响存在争议。此外，各型HCV感染诱导中和抗体是否各有不同的表观特征有待观察。 本课题从研究二硫键对HCV包膜E2蛋白的构象和功能入手，对HCV感染诱导包膜蛋白抗体以及中和抗体的特征进行了较系统探究，研究结果为认识HCV包膜蛋白的结构以及HCV免疫逃避的机制提供了新的线索，并有助于HCV疫苗的研发。 一、丙型肝炎病毒包膜蛋白E2半胱氨酸突变对其结构和功能的影响 本研究中我们将1a型H77株和1b型Con-1株HCV包膜E2蛋白中的18个半胱氨酸(cys)分别突变为丙氨酸(ala)，然后进行蛋白表达、单抗结合、二聚体形成等系列检测，发现18个cys分别突变不影响E2蛋白在细胞内的表达与分泌，但都不能包装形成感染性HCV假病毒(HCVpp)，6个半胱氨酸残基(cys494、cys508、cys552、cys564、cys607及cys644）单点突变E2不能与构象依赖型单克隆抗体H48或H53结合，另外cys429和cys503单点突变不能与H48结合。同时上述6个半胱氨酸残基（cys494、cys508、cys552、cys564、cys607及cys644）的单点突变E2蛋白与其受体CD81的结合降低80％，细胞膜表面E1和E2减少50％以上，参与形成HCVpp中的效率显著降低甚至消失。cys单点突变E2质粒免疫小鼠血清中E2抗体水平与野生型E2质粒免疫小鼠相似，突变型和野生型诱导的E2抗体均主要针对E2线性表位，且均能阻断HCVpp入侵靶细胞。结果表明二硫键在E2天然构象维持中发挥有重要作用，其中6个半胱氨酸残基(cys494、cys508、cys552、cys564、cys607及cys644)对E2构象和功能维持都十分重要，根据之后报道的E2晶体结构，这6个半胱氨酸残基组成3对二硫键，分别为cys494-cys-564、cys508-cys552及cys607-cys644。另外cys429-cys503组成1对二硫键，是E2构象依赖型中和抗体结合的关键区域。我们的结果有助于认识E2蛋白中关键局部结构和功能域的形成。 二、慢性丙肝患者血清中包膜蛋白抗体的特征分析 用半胱氨酸残基单点突变的H77株E2蛋白与一例1a亚型HCV慢性感染者者血清的反应，发现6个半胱氨酸残基cys494、cys508、cys552、cys564、cys607和cys644单点突变E2与血清的结合活性彻底消失。进一步实验发现，只有少数慢性HCV感染者者血清中存在E1抗体，约40％慢性感染者血清中存在E2线性表位抗体，但其抗体滴度较低，大部分感染者体内E2抗体主要识别构象表位。上述6个半胱氨酸单点突变导致E2与感染者血清反应的变化进一步验证了第一部分的结果，但也提出了另一个有趣的问题:HCV感染者体内应该存在针对E2蛋白中一系列的构象表位，目前从HCV感染者B细胞来源一些构象依赖性单抗识别E2的不同表位，那么，为什么这些cys单点导致E2与感染者血清的反应降低如此显著甚至彻底消失？ 另外我们发现E2抗体滴度与感染者肝功能指标之间存在一定相关性，E2抗体滴度较高的感染者其GGT、GPT、GOT也较高，说明较高的E2抗体滴度可能提示肝损伤更严重。同样地，E2线性表位抗体阳性感染者其GGT、GPT、GOT也较高。慢性HCV感染者体内诱导E2抗体的抗原可能有两种类型:病毒颗粒表面的E2蛋白和游离的E2蛋白。游离的E2蛋白可能主要由肝损伤导致肝细胞破裂释放出E2蛋白，这种E2蛋白可能会暴露更多的抗原表位，包括构象型表位和线性表位，进而诱导机体体液免疫反应，产生较高滴度的E2抗体，包括线性表位抗体。这可能是E2抗体滴度与肝功能指标相关的原因之一。本部分的研究结果加深了对慢性HCV感染者体内包膜蛋白诱导体液免疫应答的认识，有助于HCV预防性疫苗的研发。 三、不同基因型丙肝患者血清中包膜蛋白抗体的中和活性 为进一步检测慢性HCV感染者血清包膜蛋白抗体的中和活性，在H77E2质粒上构建G530A/D535A的突变，该突变能够导致E2不能与其构象依赖性中和抗体结合。分别以野生型E2和G530A/D535A突变的E2与病人血清反应，发现G530A/D535A突变主要影响与构象抗体的结合。E2线性表位抗体阳性的血清与野生型E2和G530A/D535A的反应能力相当，而以构象依赖型抗体为主的血清与G530A/D535A反应显著减弱。为进一步检测这些抗体是否能够中和HCV的感染，分别从不同基因型HCV慢性感染者血清中纯化出IgG，共得到1a型IgG2份、1b型IgG11份、2a型IgG2份、3a型IgG3份、3b型IgG2份、6n型IgG2份。分别用这些IgG对7个基因型HCVcc进行交叉中和实验，发现1a、3a、3b型IgG对同基因型HCV感染抑制能力较低;2a型、6n型来源的IgG对同基因型HCVcc感染具有很高的中和活性。在交叉中和活性方面:1a、1b、2a、3a、3b和6n型HCV感染者来源的IgG都对2a、4a、6a型HCV有较强的中和作用，而对1a、3a、7a的中和活性很弱。说明慢性HCV感染者血清抗体具有交叉中和活性，但交叉中和活性有型别依赖性（仅对2a、4a、6a型HCV有很好的中和作用）。 本论文的研究结果进一步加深了我们对丙型肝炎包膜蛋白结构和抗原性的认识，为丙型肝炎预防性疫苗的研发提供了思路和方向。并且对于慢性丙肝患者血清中包膜蛋白抗体中和作用的分析，为HCV的临床用药具有一定指导意义，促进建立更加合理的HCV感染的防控策略。

目录

声明

摘要

英文缩略词表

第一部分 丙型肝炎病毒包膜蛋白E2半胱氨酸突变对其结构和功能的影响

一、前言

二、材料方法

三、结果

四、讨论

参考文献

第二部分 慢性丙肝患者血清中包膜蛋白抗体分析

一、前言

二、材料方法

三、结果

四、讨论

参考文献

第三部分 不同基因型丙肝患者血清中包膜蛋白抗体的中和活性

一、前言

二、材料与方法

三、结果

四、讨论

参考文献

小结

文献综述 丙型肝炎病毒中和抗体的研究进展

一、在读期间发表论文

二、在读期间获奖情况

三、学术会议报告

致谢