ssFABS--SELEX筛选C4--HSL特异性适配体及其体外抑制铜绿假单胞菌生物膜形成的研究

摘要

[背景] 铜绿假单胞菌为一条件致病菌，可引起严重而迁延难愈的反复感染。铜绿假单胞菌的致病性是多因素的，其毒力因子的产生受到一个名为群体感应的机制调控，该机制可使铜绿假单胞菌实现细胞与细胞间的信号交换，同时也被证明是铜绿假单胞菌生物膜形成的关键调控机制。C4-HSL是铜绿假单胞菌群体感应系统中rhl系统的自身诱导信号分子，由菌体分泌，自由进出细胞壁和细胞膜。在其浓度达到阈值后，可与rhlR基因结合启动相关毒力因子表达和生物膜形成。因此，抑制菌群的群体感应，干扰其生物膜形成，成为近年来的抗铜绿假单胞菌感染治疗的新策略。 在体外生物膜培养模型下，C4-HSL信号分子浓度远超其它群体感应系统的信号分子，是铜绿假单胞菌体外生物膜形成的关键因子。因此，抑制C4-HSL信号分子与rhlR的结合，可在体外模型中有效地抑制铜绿假单胞菌的群体感应系统，达到抑制其生物膜形成的目的。 [目的] 由于C4-HSL为小分子化合物，不适宜制备单克隆抗体以及采用传统的固定靶标分子的SELEX技术筛选适配体。因此，本研究旨在构建一个分子变构流式荧光SELEX技术筛选C4-HSL的高亲和力高特异性适配体，用于体外结合并阻断rhl系统的信号通路，抑制铜绿假单胞菌的群体感应，达到抑制其生物膜形成的目的。 [方法] 1.合成一个中间带有15个nt固定序列、固定序列两端各有30个和10个随机寡核苷酸、含上下游引物区的全长99nt的随机ssDNA文库pool99，以及一条可与中间固定序列杂交的反向互补的捕获序列C50。该捕获序列5'端修饰荧光基团cy3，3'端修饰生物素。再合成可与随机文库下游引物区杂交的淬灭序列SQ，SQ的3'端修饰淬灭基团BHQ-1。 2.将pool99、C50、SQ杂交形成三聚体，再与包被有亲和素的聚丙烯微球连接，组装成Bead-pool99-C50-SQ复合体。由于荧光共振能量转移，复合体不发荧光。加入靶标分子C4-HSL后，能与C4-HSL结合的ssDNA结合的发生分子构象改变从复合体上解离。以流式荧光微球技术检测解离后的微球荧光增强幅度作为ssDNA解离量的表征。解离的ssDNA经PCR扩增后再用于次轮SELEX循环。微球荧光增强幅度达到平台期时，结束分子变构流式荧光SELEX筛选。 3.将最后一轮筛选出的ssDNAPCR扩增后TA克隆、转化感受态细菌DH5a，经“蓝白斑”筛选并测序，得到ssDNA一级序列。将ssDNA序列用ClustalW和MEGA软件进行序列比对，绘制序列进化树并分成若干家族，再用RNAstructure软件绘制ssDNA的二级结构，3dRNA模拟其三级结构，并解析其结构特点。结合结构相似性和结构自由能决定候选适配体用于亲和力、特异性分析和体外抑制生物膜形成的功能试验。 4.采用单位点饱和结合法测定适配体与C4-HSL结合的解离常数，作为适配体亲和力的表征。 5.采用与C4-HSL结构非常近似的2-5(H)-呋喃酮作为竞争物，比较同等反应条件下，二者与适配体结合的量，分析适配体的特异性。 6.采用扫描电镜法和结晶紫染色法，加入高浓度的适配体后体外培养铜绿假单胞菌野生菌株的生物膜，并与pool99处理的野生菌株和正常培养的△rhlI/△lasI缺陷菌株形成的生物膜比较，观察适配体体外抑制生物膜形成的效果。 [结果] 7.Bead-pool99-C50-SQ复合体的组装效率可达99％以上，可有效保证随机pool的多样性容量。 8.分子变构流式荧光法可用于SELEX筛选的监测，至第十轮SELEX结束时，微球荧光增强幅度即已达到平台期，继续筛选3轮结束SELEX筛选。 9.所得ssDNA经TA克隆、蓝白斑筛选测序后得到47条ssDNA序列，序列重复率25.5％;经序列比对和进化树分析，去除聚类较差的17条序列后，可分为9个家族共28条序列，序列重复率达42.9％。重复率较高提示SELEX筛选良好。 10.家族内序列比对，一致性均超过98％，每两条序列间的多态位点不超过2个碱基。二级结构显示，家族内二级结构一致。 11.经Multilign进行家族间二级结构相似性比对后，发现每个家族均有一致性较高的“Y”型结构，提示所有家族的适配体均具有相同的亲和力和特异性。三级结构模拟显示，“Y”型结构通过螺旋、卷曲和缠绕形成复杂的沟槽和孔洞结构，与二级子结构的对应良好，Y型结构极有可能为适配体结合C4-HSL的结合域。 12.单位点饱和结合法测试，适配体结合C4-HSL的解离常数Kd达到28.47nM，亲和力较高，解离常数达到nM水平。2-5(H)-呋喃酮测试特异性显示，适配体与2-5(H)-呋喃酮的结合率只有C4-HSL的1/97至1/25，特异性良好。 13.扫描电镜观察发现，经适配体处理的铜绿假单胞菌野生菌株的生物膜，呈现稀薄、疏松、网状分布现象，局部未融合成片，菌体没有被生物膜完全包裹，没有皲裂和塌陷现象，整体显示尚处于发育期。Pool对照组与之相比，则显得非常致密厚实，融合成片，完全包裹菌体，多处出现皲裂和塌陷现象，整体显示已进入剥脱散播期。适配体抑制生物膜形成效果显著。 14.结晶紫染色生物膜，再脱色测OD值实验证实，经适配体处理的生物膜的OD值只有未经处理的25％左右，适配体抑制生物膜形成效果显著。 [结论] 本研究成功构建了分子变构流式荧光SELEX技术筛选C4-HSL的DNA适配体，该技术可实时监测SELEX筛选。筛选得到的适配体二级结构一致，具有较高的与C4-HSL结合的亲和力和特异性。体外抑制生物膜形成试验证实，筛选得到的适配体可有效地抑制生物膜形成，抑制效果显著，为开发干扰铜绿假单胞菌群体感应、抑制其生物膜形成的适配体新药提供了实验基础。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

第一部分 筛选C4-HSL特异性适配体的分子变构流式荧光SELEX方法建立

一．材料和方法

二．结果

三、讨论

四、本部分小结

第二部分 适配体的鉴定和生物信息学分析

一．材料和方法

二、结果

三、讨论

四、本部分小结

第三部分 适配体体外抑制生物膜形成实验

一．材料和方法

二、结果

三、讨论

四、本部分小结

全文总结

文献综述 群体感应在铜绿假单胞菌毒力因子表达调控中的作用

参考文献

致谢