海洋小孢子真菌中大黄酚对小鼠小胶质细胞激活的保护作用

摘要

目的： 神经退行性疾病是全球老年人中发病率较高的疾病之一，它是以神经细胞的功能和结构丧失甚至死亡为病理特征的疾病，病情的恶化会导致患者的认知和运动功能障碍及不同程度的疼痛等。近年来，小胶质细胞激活在脑缺血、阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD），帕金森病（Parkinson’s disease,PD）等神经退行性疾病的发生和发展过程中的作用成为备受人们关注的一个热点。当机体处于应激状态如感染、外伤、脑缺血缺氧或者毒性物质侵害等损伤时，小胶质细胞即从静息状态转化为激活状态，胞体变大，突起变粗变短，逐渐变为阿米巴样巨噬细胞，从而有效地发挥其吞噬功能，维持中枢神经系统内环境的稳定；另一方面，过度或长期激活的小胶质细胞会产生和释放大量的炎症因子，如NO、COX-2、TNF-α、IL-1β和IL-6等，使炎症反应不断的放大，进一步加重神经元的损伤，进而参与了多种神经退行性疾病的发生与发展过程。因此，假想如果通过药物对小胶质细胞的氧化应激及炎症反应进行调控，是否可以减缓疾病的发生或者减轻疾病的症状？ 近年来，科学工作者对海洋生物来源的天然产物的研究越来越重视，这其中海洋真菌代谢途径复杂、次级代谢产物结构新颖并具有较好的生物活性，因此，研究人员以海洋真菌为材料，对其提取物的抗氧化和抗炎活性进行了研究，并从中分离出了一些具有较好的抗氧化、抗炎作用的天然产物，并进行了一系列的细胞实验，结果表明海洋真菌是寻找生物活性物质的理想来源。 本研究从前期实验获得的四十种真菌菌株中通过抗氧化、抗炎活性的筛选，选择提取物抗炎活性较好的一株海洋真菌为研究对象，利用活性跟踪的方法分离和鉴定其中的抗炎活性的单体，并利用过氧化氢（H2O2）和脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）诱导小鼠小胶质细胞建立氧化损伤和炎症模型，研究分离所得活性单体抗氧化损伤和抗炎症作用，并进一步研究其作用机制，为筛选预防和治疗神经退行性疾病的药物提供一定的实验依据。 方法： 1.从前期实验获得的四十种真菌菌株中通过抗氧化、抗炎活性的筛选，选择提取物抗炎活性较好的一株海洋真菌为研究对象，并进行大规模培养，运用硅胶柱层析，Sephadex LH-20柱层析及半制备型高效液相色谱法分离具有潜在抗氧化或抗炎作用的单体，并通过电喷雾质谱（ESI-MS），1D和2D核磁共振（NMR）等分析手段，确定其化学结构。 2.采用H2O2诱导的小胶质细胞氧化应激模型来研究天然活性单体的抗氧化活性，采用MTT法观察其对H2O2诱导的小胶质细胞氧化损伤的保护作用，并用DCFH-DA法检测其对H2O2诱导的小胶质细胞中ROS的抑制作用，SDS-PAGE法观察期对DNA损伤的保护作用，并采用RT-PCR和Western Blot法检测其对细胞内抗氧化酶SOD和GSH及其基因表达的影响。 3.通过LPS诱导的小胶质细胞炎症模型，观察大黄酚对LPS诱导的小胶质细胞中NO、PGE2和促炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6生成水平的影响，并通过RT-PCR和Western Blot法观察iNOS和COX-2的基因和蛋白表达的影响，最后拟研究大黄酚对LPS激活的MAPK信号通路的影响，以阐述其发挥抗炎作用的机制。 结果： 1.运用柱色谱及制备型高效液相法分离纯化得到天然活性单体，经过分析所得活性天然产物的光谱数据，并且参照相关文献，确定了其化学结构为大黄酚，本研究首次从海洋真菌小孢子真菌分离得到了大黄酚。 2.大黄酚在10μM和50μM时，可显著提高H2O2诱导BV2细胞活力；其次大黄酚能够明显的抑制H2O2诱导的小胶质细胞中ROS的生成，并呈现剂量依赖关系。大黄酚对小胶质细胞中SOD和GSH的表达具有正向调节作用，提示大黄酚是通过上调抗氧化酶及GSH的表达来清除小胶质细胞内ROS及自由基清除，从而抑制小胶质细胞的氧化应激损伤。 3.不同浓度的大黄酚（5μM,10μM,50μM）可明显下调LPS诱导的BV2小胶质细胞中的iNOS和COX-2在基因水平和蛋白水平的表达，进而抑制激活后的BV2小胶质细胞内NO和PGE2的生成。大黄酚在同等浓度下，可显著的抑制LPS诱导的BV2小胶质细胞中TNF-α，IL-1β和IL-6等促炎症因子的生成，并且可抑制其mRNA的表达，这种抑制作用呈现剂量依赖关系。最后通过对小胶质细胞p38、JNK和ERK的磷酸化水平变化的观察，结果显示大黄酚可能是通过抑制MAPK通路而产生了一系列的抗炎作用。 结论： 本实验从海洋真菌小孢子真菌首次分离得到了大黄酚，然后在H2O2诱导的小鼠小胶质细胞氧化损伤模型中验证了大黄酚的抗氧化作用，其机制可能是通过上调BV2细胞内SOD和GSH等抗氧化酶的表达来发挥ROS清除及自由基清除作用。最后通过LPS诱导的BV2细胞炎症损伤模型发现大黄酚的抗炎症作用，研究结果提示大黄酚可能通过抑制p38、JNK和ERK信号通路的激活，进而抑制小胶质细胞激活后释放促炎症因子。本研究为大黄酚在神经系统退行性疾病中的应用提供一定的实验依据。

目录

第一个书签之前