脓毒症大鼠结肠粘膜和肠道内容物中部分细菌粘附因子和受体表达的变化和意义

摘要

脓毒症是严重感染、休克、重度创伤、重大手术过后较为常见的并发症，如果病情持续发展可以导致患者出现多器官功能障碍综合征（MODS）、脓毒症休克，甚至死亡，目前，脓毒症及其相关并发症已经成为临床上许多危重病患者死亡的重要原因之一。最近研究认为，机体创伤应激的中心器官是胃肠道，强调了肠道是MODS的始动器官。胃肠道是人体内最大的细菌库，人体微生物中总量的78%是肠道的微生物，人类肠道中细菌总量大约有1kg，其中大约有1013～1014个活菌，肠道的正常菌群主要由原籍菌和部分密度较低的环境菌群以及外籍菌群构成，肠道每种细菌保持稳定比例和数量分布在机体胃肠道的不同位置，起着其相应的作用。肠道菌群中优势菌为专属厌氧菌如双歧杆菌、乳酸杆菌等，还有较少兼性厌氧菌和需氧菌。正常情况下，肠道中细菌的种类和每种细菌的数量是相对固定的，肠道细菌自身更新的过程使细菌数量一直保持动态平衡，在脓毒症疾病变化过程中，由于疾病的影响，使得肠道细菌在肠道粘膜上的数量和种类发生了变化，打乱了机体原有的生态平衡系统，损伤肠道的屏障功能，容易发生细菌移位及其他机体代谢异常，影响疾病的转归。细菌定植是细菌粘附肠道的重要步骤，细菌在肠道完成定植后才能克隆生长，细菌在肠道上定植，是通过细菌自身粘附因子和肠道上皮的粘附因子受体二者结合完成的。细菌在肠道的定植力大小是影响细菌在肠道粘膜上生长的重要因素，脓毒症情况下，这些细菌在肠道的定植力发生如何变化，目前研究较少。本课题旨在通过研究脓毒症大鼠结肠粘膜上皮上部分粘附因子受体的表达情况，以及肠道内容物中部分益生菌和致病菌粘附因子的表达情况，来了解发生脓毒症后部分肠道细菌定植力的变化，为脓毒症后出现肠道细菌移位提供理论依据。另外，虽然有更强、更高级抗生素使用于临床，但脓毒症的死亡率并没有明显下降，抗生素是把双刃剑，对肠道益生菌和致病菌都有杀灭作用，抗生素治疗除了直接杀灭细菌外，对肠道细菌定植力有怎样的影响，本研究希望通过观察脓毒症大鼠使用抗生素后部分益生菌和致病菌的粘附因子变化，了解抗生素对肠道细菌定植力的影响，为抗生素治疗提供理论参考。 第一部分 脓毒症大鼠结肠粘膜asialo-GM1、asialo-GM2表达的动态变化和意义 目的：观察asialo-GM1、asialo-GM2在脓毒症大鼠结肠粘膜中的表达，探讨asialo-GM1、asialo-GM2在脓毒症发病机制中的作用。 方法：SD大鼠96只，按随机数字表分为脓毒症组，假手术组和正常组，每一组32只。假手术组和脓毒症组根据术后取标本的时间各自又随机分为1周、2周、3周、4周四个亚组，每个亚组8只，制定脓毒症和假手术组模型，在规定的时间点内按要求取结肠粘膜标本，正常组随机分4组，每组8只，在与手术组相对应的时间节点按要求取结肠粘膜标本。实时荧光PCR法检测标本中asialo-GM1、asialo-GM2mRNA的表达，用蛋白印迹法检测asialo-GM1、asialo-GM2的蛋白表达。 结果：脓毒症组结肠粘膜中asialo-GM1基因和蛋白表达高于同期正常组和假手术组，asialo-GM1基因表达前3周呈上升，第4周有回落，asialo-GM1蛋白表达第4周最高（P＜0.05)；脓毒症组asialo-GM2基因第2、3、4周高于同期正常组和假手术组，前3周逐渐升高，第4周回落，asialo-GM2蛋白表达2、3、4周高于同期正常组和假手术组，第3周表达最高（P＜0.05)。 结论：脓毒症后大鼠结肠粘膜asialo-GM1、asialo-GM2表达一定时间内增加，提示脓毒症大鼠结肠粘膜部分粘附因子受体表达上调，对细菌的吸附能力增加。 第二部分 脓毒症大鼠结肠内容物CFA/Ⅰ、SpaB表达的动态变化及意义 目的：观察CFA/Ⅰ、SpaB在脓毒症大鼠结肠内容物中的表达，探讨CFA/Ⅰ、SpaB表达在脓毒症发病机制中的作用。 方法：SD大鼠96只，按随机数字表分为脓毒症组，假手术组和正常组，每一组32只。假手术组和脓毒症组根据术后取标本的时间各自又随机分为1周、2周、3周、4周四个亚组，每个亚组8只，制定脓毒症和假手术组模型，，在规定的时间点内按要求取结肠内容物标本，正常组随机分4组，每组8只，在与手术组相对应的时间节点按要求取结肠内容物标本。实时荧光PCR法检测标本中CFA/Ⅰ、SpaBmRNA的表达，用蛋白印迹法检测CFA/Ⅰ、SpaB的蛋白表达。 结果：脓毒症组大鼠结肠内容物CFA/ⅠmRNA和蛋白的表达高于同期正常组和假手术组，CFA/ⅠmRNA的表达前3周上升，第4周回落，CFA/Ⅰ蛋白的表达呈逐步上升趋势（P＜0.05)；脓毒症组大鼠结肠内容物SpaB mRNA的表达低于同期对照组，SpaB蛋白的表达第4周低于假手术对照组和正常组（P＜0.05)；脓毒症大鼠结肠内容物SpaB蛋白表达呈下降趋势，第4周明显降低（P＜0.05)。 结论：脓毒症大鼠结肠内容物CFA/Ⅰ表达增加、SpaB表达减弱，提示脓毒症大鼠结肠内产毒性大肠杆菌粘附能力增加，益生菌鼠李糖杆菌的粘附力降低。 第三部分 抗生素对脓毒症大鼠结肠内容物SpaB、SpaE、CFA/Ⅰ表达的影响及意义 目的：观察使用用抗生素后，肠道内容物中细菌SpaB、SpaE、CFA/Ⅰ表达的变化，探讨抗生素对脓毒症大鼠肠道细菌粘附力的影响。 方法：SD大鼠64只，按随机数字表分为脓毒症抗生素治疗、脓毒症组、假手术组和正常组，每组16只。制定脓毒症和假手术组模型，脓毒症抗生素治疗组在脓毒症模型成功后，立即给予腹腔内注射环丙沙星，剂量按照（400mg/60kg）×6.26×大鼠体重（kg），以后每天固定时间注射一次。所有手术的大鼠按手术后取标本的时间，随机分为后1周、2周二个亚组，术后按要求取结肠内容物标本，正常组在相应时间点取结肠内容物标本。实时荧光PCR法检测结标本中SpaB、SpaE、CFA/ⅠmRNA的表达，用蛋白印迹法检测SpaB、SpaE、CFA/Ⅰ的蛋白表达。 结果：脓毒症抗生素治疗组SpaB、SpaE表达低于同期脓毒症组；脓毒症抗生素治疗组CFA/Ⅰ的表达第2周高于同期脓毒症组（P＜0.05)。 结论：抗生素治疗抑制脓毒症大鼠结肠内容物中SpaB、SpaE表达，不能持续降低CFA/Ⅰ的表达，提示抗生素使用一定时间后，能增加产毒性大肠杆菌的粘附能力。

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