三种方法制备猪小肠黏膜下层细胞外基质的对比研究

摘要

研究目的： 生物材料属天然细胞外基质(ECM)，经过机械法、化学法、酶学法等方法，除去原组织中的DNA及细胞，再通过交联、消毒等处理后制备而成，具有一定的机械强度，且低免疫原性。以P-SIS为例，其结构绝大多数为Ⅰ型和Ⅲ型胶原纤维，含量超过90％。P-SIS在保留一定机械强度的条件下，还包含多种细胞因子，如基本成纤维细胞生长因子(Basic fibroblast growthfactor，bFGF)、转化生长因子（Transforminggrowth factor，TGF）、表皮生长因子(Epidermal growth factor，EGF)、血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)、胰岛素样生长因子-1（Insulin-like growthfactor-1，IGF-1）以及葡糖氨基聚糖类、纤连蛋白类、软骨素、透明质酸，这些成分对组织重塑和伤口愈合起重要作用[1-2]。P-SIS已经广泛应用于现代生物医学领域，如肌腱重建、下泌尿道重建、硬脑膜修补、血管重建、修复部分或全层皮肤损伤[3-5]。生物材料除了拥有与合成材料一样的疝修补低复发率，同时在生物相容性、抗粘连性等方面也较人工合成材料更为理想，术后疝复发、腹腔感染，肠梗阻、瘘形成等不良反应的发生率明显较低[6]。 细胞外基质虽有以上所述的种种优点，但对于某一种ECM的制备方法却没有统一标准;由于各种ECM结构差异较大，应用相同脱细胞方法较难达到理想结果。目前常用的脱细胞方法主要分为三大类:物理方法、化学方法和消化酶学方法。如果应用的试剂剂量过小，可使细胞成分残留较多，植入机体后易引起机体免疫排斥反应，局部组织粘连严重、组织包裹钙化等;若应用大剂量试剂，能将细胞除去干净，又同时会对ECM本身结构造成损伤[7]。因此，如何较彻底清除ECM中的细胞和DNA成分，并尽可能减少对ECM组织结构的破坏，保持其原有的生物活性、力学特性，是当今脱细胞处理方法的研究热点。 本实验小组拟在以上研究基础上，系统比较三种不同方法制备猪小肠粘膜下层(P-SIS)的体外单轴力学抗拉力、DNA浓度测定、生长因子含量的测定、及切片染色等结果，并用三种不同方法制备的P-SIS对大鼠腹壁部分缺损进行修复，观察修复后区域抗张力、修复后局部及全身的免疫原性等情况，明确三种不同方法制备P-SIS的差异，为寻找优良的制备方法提供依据。综合分析三种不同方法制备P-SIS修复后大鼠腹壁缺损效果，为选择良好的制备方法提供实验依据。 研究方法： 三种方法制备猪小肠黏膜下层:取4h内市售新鲜猪空肠，分别采用机械法脱细胞、酸碱法脱细胞、SDS法脱细胞，制备P-SIS生物补片。每步操作后留取样品(n=10)，分别作为A、B、C组;以新鲜猪空肠作为对照。 动物体外测试:①将三种方法制备好的材料分别进行材料单轴力学测试（由上海同济大学医学院生物力学测试实验室协助完成），②采用HE染色、Masson染色、天狼猩红染色、PAS染色（由上海长征医院病理科协助完成）、DNA凝胶电泳等实验方法明确不同方法制备P-SIS的细胞或DNA含量;③采用Elisa方法检测生长因子VEGF、TGFβ1的残余量。 动物体内测试和评估:分别用三种不同方法制备的P-SIS修补大鼠腹壁部分缺损模型，通过腹腔注水实验、修补区域免疫组化测定炎性细胞、Ellisa方法测定炎性介质等方法，评价其各组术后抗张力及免疫炎症反应。 研究结果： 1、动物体外测试:通过单轴力学拉伸实验结果分析，酸碱组制备的P-SIS拉伸强度、最大伸长率优于SDS组和机械组(P＜0.05);通过各种染色、及DNA浓度测定可以得出，酸碱组DNA含量明显低于其他两组(P＜0.05)，且酸碱组弹性纤维结构排列整齐，而SDS组弹性纤维结构松散、部分纤维已出现断裂;通过Ellisa方法测定生长因子TGF-β、VEGF含量得出，酸碱组生长因子含量较SDS组高(P＜0.05)。 2、动物体内测试和评估:术后36只SD大鼠均存活，无明显感染、血肿及腹壁疝形成等情况，腹壁部分缺损修复完整。通过对三组术后8周大鼠进行腹腔注水试验，均未见修补区域膨出、腹壁疝形成(P＞0.05);通过Ellisa方法测定血清中IL-6、TNF-α含量的结果得出，酸碱法制备的P-SIS植入动物体内后，IL-6、TNF-α含量均较SDS组和机械组低(P＜0.05);通过免疫组化检测局部修复区炎性细胞含、内皮增生细胞含量，得出结论，酸碱组结果总体优于SDS组和机械组(P＜0.05)。 结论： 在三种不同方法制备的P-SIS中，酸碱法制备的P-SIS在力学特性、生长因子含量、残余DNA浓度测定方面均优于机械法和SDS法制备的P-SIS。植入机体后，酸碱组抗张力无明显降低，且在引起机体免疫反应、内皮增生细胞含量测定方面，酸碱组优于其他两组，综上所述，本实验认为酸碱法在三种方法中最优。

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摘要

缩略词表

前言

第一部分 三种方法猪小肠黏膜下层细胞外基质的制备及其体外性能测试

一、三种方法猪小肠黏膜下层生物材料的制备

二、三种方法制备的P-SIS材料体外测试

三、讨论

第二部分 三种方法制备的猪小肠黏膜下层细胞外基质修复大鼠腹壁部分缺损后效果比较分析

一、动物模型的制备

二、三种方法制备的P-SIS修复大鼠腹壁部分缺损效果比较分析

二、结果

三、讨论

全文总结

综述 细胞外基质脱细胞方法及临床应用的研究进展

附录一 第二军医大学实验动物中心动物实验申请单

附录二 第二军医大学实验动物伦理审查申请书

致谢