抗PLA2R抗体检测方法的建立及在膜性肾病中的应用

摘要

目的: 构建真核重组质粒，体外表达PLA2R蛋白;运用双抗夹心原理建立抗PLA2R抗体的间接免疫荧光检测方法(IIFT);通过检测MN患者血清和尿液抗PLA2R抗体，观察血清和尿液抗体与患者疾病严重程度和组织病理改变的相关性。 方法: 1.PLA2R真核重组质粒的构建和蛋白表达 基因库查找PLA2R全长mRNA序列，合成全长基因，构建pcDNA3.1/Hygro-PLA2R-IRES2-eGFP和pcDNA3.1/Hygro-PLA2R-His重组质粒。通过Lipofectamine2000介导质粒瞬时转染HEK293T细胞，进行目的蛋白表达，运用流式细胞技术、免疫荧光、免疫组化和WB方法对表达蛋白进行鉴定。 2.抗PLA2R抗体IIFT的建立与验证 用表达目的蛋白的HEK293T细胞作为捕获抗原与MN患者血清中的抗PLA2R抗体进行结合，再用二抗进行荧光标记，建立抗PLA2R抗体IIFT。用自建的抗体检测方法对150例肾小球疾病患者和30例健康成人血清进行检测，同时用国外检测试剂盒作为对照，评价自建检测方法的有效性，明确抗体对原发性MN患者的诊断特异性。 3.抗PLA2R抗体在MN中的临床研究 收集长征医院114例原发性MN和18例存在继发因素MN患者的血清、尿液，用自建的抗PLA2R抗体IIFT对患者血清和尿液进行定性检测，记录患者的临床资料和病理报告，采用聚合免疫散射法对患者血清IgG和IgG4进行定量检测。观察原发性MN患者血清抗体阳性组和阴性组的临床指标和病理的差异性，并对血清IgG和IgG4值进行分析;将血清抗体阳性的原发性MN患者分为尿液阳性组和阴性组，观察两组患者临床指标和病理分期的差异性。对存在继发因素MN患者的血清和尿液抗体进行检测，观察抗体的阳性率。 结果: 1.选取基因库中PLA2R的1型转录体全长mRNA(NCBI，NM_007366.4)作为目的基因，合成全长碱基序列，通过酶切手段构建PLA2R的真核重组质粒pcDNA3.1/Hygro-PLA2R-IRES2-eGFP和pcDNA3.1/Hygro-PLA2R-His，运用Lipofectamine2000将重组质粒瞬时转染HEK293T细胞，通过免疫组化、流式细胞学技术、免疫荧光和WB方法鉴定PLA2R蛋白的表达。 2.用表达PLA2R蛋白的HEK293T细胞作为捕获抗原，建立抗PLA2R抗体的IIFT。用该方法对150例肾小球疾病患者和30例健康成人血清进行检测，结果抗体仅出现在原发性MN患者血清中，其它肾小球疾病和健康成人均为阴性，自建检测方法与国外试剂盒的检测结果一致。 3.114例原发性MN患者有84例(73.68％)血清抗体阳性，阳性组血清白蛋白、甘油三酯、肌酐、IgG、24h蛋白尿、尿TRF、IGU、eGFR和组织病理分期与阴性组存在差异(p＜0.05)，而血清胆固醇、IgG4及IgG4/IgG值间差异无统计学意义(p＞0.05);18例存在继发因素的MN患者有6例血清抗体阳性。血清抗体阴性患者的尿液抗体均阴性，84例血清阳性患者有60例(71.42％)尿液抗体阳性，占总例数的52.63％;尿液阳性组血清白蛋白、肌酐、尿TRF、IGU和eGFR与阴性组存在差异(p＜0.05)，而血脂、24h蛋白尿、血清IgG、IgG4、IgG4/IgG和组织病理无统计学差异(p＞0.05);6例存在继发因素、血清抗体阳性的MN患者有4例尿液抗体阳性。 结论: 本课题构建的PLA2R真核重组质粒能表达PLA2R蛋白，自建的抗PLA2R抗体IIFT能有效检测MN患者的抗PLA2R抗体。检测抗PLA2R抗体可以作为诊断原发性MN的一种方法，其在原发性MN血清中的阳性率为73.68％，在尿液中阳性率为52.63％;抗PLA2R抗体在存在继发因素的MN患者血清中有部分阳性，但未在其他肾小球疾病和健康人群血清中检测到。血清抗体与患者的临床指标显著相关，而尿液抗体可能与患者肾功能损伤程度有关，抗体的出现提示患者临床病情和肾脏损伤程度加重。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

第一部分 PLA2R真核重组质粒的构建和蛋白表达

材料与方法

一、主要材料

二、方法

结果

一、PLA2R质粒的合成

二、pcDNA3．1／Hygro-PLA2R-IRES2-eGFP质粒的构建和蛋白表达鉴定

三、pcDNA3．1／Hygro-PLA2R-His质粒的构建和蛋白表达鉴定

讨论

第二部分 抗PLA2R抗体IIFT的建立与验证

材料与方法

一、主要材料

二、方法

结果

一、抽提质粒浓度检测结果

二、肾小球疾病患者和健康成人临床资料

三、血清抗PLA2R抗体检测结果

讨论

第三部分 抗PLA2R抗体在MN中的临床研究

材料与方法

一、主要材料

二、方法

结果

一、患者的一般资料

二、MN患者血清抗PLA2R抗体检测

三、MN患者尿液抗PLA2R抗体检测

讨论

全文总结

参考文献

综述 抗M型PLA2R抗体在特发性膜性肾病中的研究进展

在读期间完成和发表的文章

致谢