Mer酪氨酸激酶受体在非小细胞肺癌中的表达、临床意义及介导厄洛替尼耐药机制研究

摘要

肺癌是人类的重要的死因之一。在世界范围内，2012年有一百六十万人死于肺癌。其中中国死亡人数占其中40％。根据不同的组织来源，肺癌可以分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌。非小细胞肺癌不仅是肺癌中主要的组成成分，占所有肺癌发病率中80-85％，并且表现出较高恶性程度，其五年生存率仅有17％。 肿瘤的发生主要是由于环境中致癌因子造成机体DNA突变，根据“二次打击”学说，导致正常细胞转化为恶性细胞。对于能够促进肿瘤细胞异常增殖的基因称之为原癌基因，而另一类抑制细胞恶性增殖的基因则为抑癌基因。原癌基因的基因突变一直是肿瘤诊断和治疗的热点，根据以往的研究表明，肺癌中基因突变就有EGFR（50％），ALK（5％），KRAS（10-20％），PI3KCA（3％），BRAF（3％），ROSI（1％），c-MET（2％）和ERBB（2％）突变[1]。由此针对这些突变靶标的化学药物和抗体靶向药物，在非小细胞肺癌中的治疗应用效果显著[2]。而单基因突变导致的肿瘤仅仅是肿瘤发生中的一小部分。通常肿瘤的发生发展是一个多因素多基因改变的过程，经常有多种基因的突变或协调作用的参与。故对于非小细胞肺癌其他的肿瘤驱动基因的寻找迫在眉睫[3]。 Mer蛋白属于Tyro3，Axl和Mer（TAM）酪氨酸激酶家族成员，由人MERTK基因编码转录而成[4]。Mer蛋白是一类跨膜蛋白，具有2个纤连蛋白3型结构与，2个免疫球蛋白C2型结构与和1个酪氨酸激酶结构域。其膜外端可以由金属蛋白酶剪切后产生可溶性片段脱落[5]。Mer蛋白主要在单核细胞、上皮细胞和生殖组织中高表达。其配体Gas6的结合可以诱导Mer蛋白自身磷酸化和下游通路的启动，从而调控细胞粘附、迁移和存活等各功能。而Mer蛋白与肿瘤的关系也是近几年研究的热点。因为酪氨酸激酶受体的异常激活在多种肿瘤中均有报道，包括血液肿瘤、脑胶质瘤、黑色素瘤、前列腺癌、乳腺癌、结肠癌、胃肠道肿瘤、垂体瘤和横纹肌肉瘤[6]。之前对于Axl的研究表明Axl是非小细胞肺癌重要的治疗靶标，尤其是在肺腺癌中，Axl的表达水平和肿瘤的进展、肿瘤细胞的恶性程度以及肿瘤对于化疗和靶向治疗的耐药性均密切相关[7-11]。而对于Mer同样的酪氨酸激酶家族成员，与癌旁正常组织相比，在70％的非小细胞肺癌中均为过表达状态。功能研究表明Mer可以增强肿瘤细胞的克隆形成能力并抑制凋亡通路的激活维持生长，从而促进肿瘤细胞的对化药的耐受性[3]。shRNA敲除实验则逆转了Mer的功能，抑制肿瘤细胞的克隆形成，增强了肿瘤细胞的化学敏感性，并且在动物模型上抑制肿瘤形成[3]。所以说，Mer在非小细胞肺癌中是一个重要的潜在靶标[12]。 但是以上对于Mer表达的研究，非小细胞肺癌的样本量均偏小，并对于Mer介导的致癌通路还需要进一步研究。而且据报道，巨噬细胞组成的表达Mer受体并且通过Mer受体介导对于凋亡细胞的胞吞作用来维持自身耐受的稳态[13]。免疫抑制剂的使用能够诱导Mer的表达[14]。鉴于在肿瘤微环境中广泛存在肿瘤相关的巨噬细胞以及免疫抑制因子，所以对于肿瘤微环境中尤其是间质细胞的Mer表达水平的鉴定将具有重要的临床意义。 在本部分研究中，首先通过150例非小细胞肺癌的组织芯片进行Mer的免疫组化研究，发现在不同的肺癌标本中，约67％的患者表现出Mer过表达，并且发现在间质中一类巨噬细胞样细胞显示高Mer表达水平。同时对于30例新鲜的非小细胞肺癌组织行免疫组化进一步验证了Mer在肿瘤细胞的表达和自身磷酸化水平明显高于正常组织。SPSS生存分析显示Mer的表达水平不直接与患者的总体生存期相关，但是与肿瘤的分期和分化水平具有一定的相关性。 通过选取表达缺失的BEAS2B和PC9细胞作为模型，进行慢病毒转染后过表达Mer基因，筛选获得稳定过表达Mer的BEAS2B和PC9细胞。通过观测倍增时间，发现过表达Mer的细胞增殖速度明显快于对照细胞。平板克隆实验显示过表达Mer的细胞具备更强的增值能力，比对照组高了一倍（p<0.05)，为89±5.4个／皿，但是在裸鼠上，正常的支气管上皮细胞尽管高表达Mer也不具备成瘤能力。划痕实验进一步确认了Mer的表达增高能够增强细胞的迁移能力。接着在蛋白质水平上，确定Mer的激活也相应引起ERK1/2、AKT和FAK磷酸化水平上调。应用Mer特异性阻断剂则逆转细胞过度增殖和迁移效果。对于下游信号通路的检测，发现Mer蛋白通过不同的通路来调控其对肿瘤的增殖和迁移能力。MAPK信号通路的激活使得过表达Mer的细胞具备更强的增殖能力，而FAK通路激活主要影响细胞迁移能力。 为了进一步了解Mer在厄洛替尼治疗非小细胞肺癌耐药性中的影响，通过之前构建的过表达Mer的PC9细胞株进行厄洛替尼处理，发现过表达Mer能够增加细胞对于靶向药物的敏感，表现为凋亡现象减少。Mer则能逆转细胞对于厄洛替尼耐药性的现象。 我们的结果首次阐明了Mer在非小细胞肺癌中表达上调。Mer通过MAPK信号通路介导非小细胞肺癌的增殖，通过FAK通路来调控肿瘤的迁移能力。并且对于过表达Mer之后对于厄洛替尼耐药性可以通过应用Mer特异性抑制剂加以逆转。为Mer特异性抑制剂在非小细胞肺癌中的应用提供理论依据。

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