Rab25在非小细胞肺癌厄洛替尼获得性耐药中的作用及机制研究

摘要

近年来肺癌的发病率在全球范围内呈持续上升趋势，而这一趋势在中国尤其明显。据报道，肺癌在我国已经成为发病率和病死率最高的恶性肿瘤，对人群健康构成了严重的威胁。而在肺癌病例中，非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)占据了绝大部分。不幸的是，将近80％的NSCLC病人被诊断时已经处于晚期。他们不像早期病人能通过手术等治疗获得较高的生存率，临床上对这些病人的治疗手段也是很有限的。厄洛替尼（erlotinib）作为表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)酪氨酸酶抑制剂(Tyrosine Kinase Inhibitor, TKI)给晚期NSCLC病人，特别是对EGFR敏感突变的病人带来了巨大的希望。但是，几乎所有的病人在用药半年到一年时会产生厄洛替尼耐药。尽管现已发现多种因素参与了耐药的发生，但仍有30％左右的病人耐药的原因尚不清楚。因此，对NSCLC发生EGFR-TKI获得性耐药机制的进一步探索是当前本领域研究的热点之一。
　　Rab25是一种分布在上皮细胞的小GTP酶，其异常表达与包括肺癌等多种恶性肿瘤的发生相关。有文献报道利用基因芯片的方法研究发现Rab25可能与厄洛替尼等3种TKI耐药都相关，但其在NSCLC厄洛替尼获得性耐药中的作用和机制有待实验进一步证实。
　　经典的Wnt/β-catenin信号通路参与调控多种肿瘤的增殖分化及转移等生物学行为。研究表明，在肺腺癌NCI-H1650细胞中，EGFR的突变特别是T790M突变能磷酸化并激活β-catenin，从而介导核内反式激活，进而导致细胞对厄洛替尼的敏感性下降。而敲低β-catenin的表达能够明显改善非敏感的肺腺癌H1975细胞对不可逆性TKI(BIBW2992)的敏感性。这些证据都表明，β-catenin在TKI原发和继发性耐药中可能发挥了一定的作用。而β-catenin在PC9/ER细胞中是否也是Rab25介导的厄洛替尼敏感性的下游机制引起了我们的研究兴趣。
　　目的：
　　研究Rab25在厄洛替尼耐药细胞(PC9/ER)与亲本细胞中的表达差异;通过基因敲低手段明确其在NSCLC发生厄洛替尼获得性耐药中的作用，以期为丰富对厄洛替尼耐药的认识提供新思路、新理念。
　　方法：
　　1.在课题组前期诱导获得的耐药细胞PC9/ER基础上，传代培养并比较其与亲本细胞PC9在形态上的差异;利用CCK-8法鉴定PC9/ER细胞的耐药性，并计算耐药指数。
　　2.利用qPCR和Western-Blot比较Rab25在PC9/ER及PC9细胞间基因和蛋白表达水平的差异;利用梯度厄洛替尼浓度刺激两株细胞，比较两者Rab25蛋白水平变化及剂量依赖效应;利用免疫荧光法定位Rab25蛋白在两者细胞定位的不同。
　　3.利用siRNA和慢病毒(LV)转染技术，敲低Rab25在PC9/ER细胞中的表达，研究Rab25敲减对改善厄洛替尼耐药的作用;运用流式细胞仪检测敲减组与对照组的细胞周期变化，明确Rab25敲低对细胞增殖特性的作用。
　　4.在PC9/ER细胞敲低Rab25表达的基础上，用Western-Blot探索Wnt信号通路蛋白的改变状态，并运用激动剂LiCl对信号通路恢复活性以检测PC9/ER细胞对厄洛替尼敏感性的变化。
　　结果：
　　1.传代培养的PC9/ER及PC9细胞，在低倍镜下观察到:PC9细胞呈长梭形，而PC9/ER细胞呈类圆形;高倍镜下观察到:PC9细胞呈散在分布，PC9/ER细胞呈连续片状分布。CCK-8实验表明，PC9/ER细胞的IC50值远高于PC9细胞[（7.85±1.53）μMvs(0.12±0.04)μM，P＜0.01）]，PC9/ER细胞的耐药指数为68.21±21.42，提示耐药细胞PC9/ER可用于后续实验。
　　2.同等厄洛替尼浓度刺激条件下，Rab25的基因和蛋白表达在PC9/ER细胞均高于PC9细胞(P＜0.05);增高的Rab25蛋白主要表达于细胞膜;在PC9及PC9/ER细胞中，Rab25的蛋白水平在0-1μM厄洛替尼之间随刺激浓度的递增而增高。
　　3.成功筛选siRab25序列并转染PC9/ER细胞并敲低Rab25的表达，敲低组的IC50明显低于对照组[（0.59±0.33）vs（6.14±0.92）μM，P＜0.05];敲低组的增殖指数明显低于对照组[(0.53±0.10)vs(0.89±0.06)，P＜0.05]。
　　4.厄洛替尼作用于PC9/ER细胞后，β-catenin蛋白水平明显高于PC9细胞(P＜0.05);免疫荧光实验发现β-catenin主要表达于细胞核;β-catenin和p-GSK-3β蛋白水平在LV-Rab25组低于LV-control组;而LiCl(10mM)能在细胞浆和细胞核中升高LV-Rab25组细胞的β-catenin表达。
　　结论：
　　1.Rab25在PC9/ER细胞中高表达，对其厄洛替尼耐药具有促进作用。
　　2.Wnt信号通路的激活，导致β-catenin的核表达增加，在Rab25介导的PC9细胞厄洛替尼耐药发挥了重要作用。

目录

声明

缩略语表

摘要

第一章 前言

第二章 PC9细胞获得性耐药与Rab25表达的相关性

2．1 实验材料

2．2 实验方法

2．3 研究结果

2．4 讨论

第三章 敲低Rab25能部分改善PC9／ER细胞的敏感性

3．1 实验材料

3．2 实验方法

3．3 研究结果

3．4 讨论

第四章 Wnt信号通路激活参与Rab25介导耐药的机制

4．1 实验材料

4．2 实验方法

4．3 研究结果

4．4 讨论

全文结论

参考文献

文献综述Rab25在恶性肿瘤中的研究进展

攻读硕士学位期间发表的论文

致谢