人骨肉瘤143B原位荧光裸鼠模型的建立及贝伐单抗联合顺铂化疗研究

摘要

骨骼肌肉系统中最常见的恶性肿瘤为骨肉瘤，流行病学青少年时期（10-20岁）为骨肉瘤的发病的高峰期，大部分的骨肉瘤原发病灶位于骨生长活跃的长骨干骺端，其中绝大部分位于股骨下端和胫骨上端位置，其原因可能与青少年的时期是干骺端新生骨为最活跃阶段。骨肉瘤的病理诊断标准是观察到梭形基质细胞，这种细胞能够产生骨样组织，因此骨肉瘤标本的病理切片往往可见瘤体内呈现同时存在溶骨性和成骨性改变，经常可以观察发现骨肉瘤向骨髓腔浸润生长或者是向外生长突破骨膜后浸润及周围软组织。骨肉瘤发病以后病情进展迅速，病程往往为短期，出现肺部转移后往往提示生存期不超过6个月。近期有国外文献报道骨肉瘤在发病的早期就会向肺部转移。同时由于大部分的骨肉瘤生长部位位于称重骨骼部分，因此骨肉瘤病人有高致残率且预后不良。因此，有效的对骨肉瘤的治疗及阻止远处转移对骨肉瘤的预后评估是个重要问题。 活体荧光成像目前被广泛地应用基础生命科学研究，尤其是肿瘤研究这一领域。技术原理主要是采用特定的荧光蛋白基团对目的细胞进行转染，使其稳定的表达荧光蛋白。将其接种至活体生物后，在荧光成像仪器的作用呈现不同颜色的荧光。从而实现从对活体生物体内细胞及器官活动的观察来完成研究的目的。在肿瘤研究中为连续观察肿瘤的生长和转移过程提供了一种新的技术手段。 VEGF（血管内皮生长因子）在新生血管生成中起到了重大作用，是具有内皮细胞特异性的血管促渗透因子和促血管生成的细胞因子，既往研究发现VEGF与骨肉瘤浸润深度、远处转移等恶性肿瘤生物学关系比较密切。贝伐单抗是重组人源化单克隆抗体，能够特异性的结合VEGF，从而达到阻碍VEGF与其受体的结合，使VEGF失去生物学活性，因此可以减少新生血管的形成，从新生血管这一途径阻止肿瘤瘤体的不断增大，贝伐单抗在实体瘤的研究中已经得以广泛应用，可以为骨肉瘤的治疗提供了一个新的靶点药物。 第一部分 原位红色荧光标记143B骨肉瘤裸鼠模型的建立 目的：建立稳定表达红色荧光蛋白人骨肉瘤143B细胞株系，利用143B系细胞株建立裸鼠骨肉瘤原位荧光模型，对原位骨肉瘤的生长进行活体荧光成像观察，通过该技术实现连续的实时性、非创伤性观察骨肉瘤的肿瘤生物学行为。 方法：通过病毒载体DsRed将红色荧光蛋白基团转染进入人骨肉瘤细胞143B细胞，传代培养。将转染成功的人骨肉瘤143B细胞于裸鼠胫骨近端接种终止建立骨肉瘤原位模型，并于不同时间对裸鼠进行活体成像，观察骨肉瘤的生长变化及有无肺转移情况。 结果：获得了能持续表达红色荧光蛋白的人骨肉瘤143B细胞系，接种后于裸鼠胫骨近端成骨肉瘤，成瘤率为100%，通过活体荧光成像系统可以连续对骨肉瘤的肿瘤生物学行为进行观察。 结论：通过转染可以使红色荧光蛋白基团于人骨肉瘤143B细胞持续表达，通过活体荧光成像系统对裸鼠原位骨肉瘤模型的观察可以活体观察原位骨肉瘤的恶性肿瘤生物学行为，因此该模型可成为研究骨肉瘤的发生、发展及肺转移因素的影响因素的一种重要工具，该模型的建立方法具有简单、可靠、易重复的优点。 第二部分 活体观察贝伐单抗对裸鼠骨肉瘤原位移植模型的作用 目的：活体持续观察贝伐单抗对裸鼠人143B骨肉瘤原位模型的肿瘤生长及转移的作用。 方法：利用前述建模方法建立红色荧光蛋白标记的人骨肉瘤143-B裸鼠原位模型21只。随机分为3组：对照组，低剂量贝伐单抗治疗组（2mg/kg）和高剂量贝伐单抗治疗组（5mg/kg）。通过荧光继续观察肿瘤长情况，给药6周后处死所有动物。实验观察采用动物体重、肿瘤生长荧光成像、大体组织观察等。 结果：成功建立了红色荧光蛋白标记的人骨肉瘤143-B裸鼠原位模型，应用低剂量贝伐单抗治疗组荷瘤鼠原发肿瘤的平均体积和对照组相比无明显减小，统计学分析无显著性差异（P＞0.05)；应用贝伐单抗高剂量组体积和对照组相比减小，统计学分析上有显著性差异（P＜0.05)。各组之间的肿瘤肺部转移率无统计学差异。 结论：高剂量贝伐单抗对人骨肉瘤143-B肿瘤生长具有抑制作用，贝伐单抗对人骨肉瘤143-B肺部转移无明显抑制作用。 第三部分 活体观察贝伐单抗联合顺铂对裸鼠人骨肉瘤模型的生存时间影响作用 目的：观察贝伐单抗及联合顺铂，对人骨肉瘤细胞移植瘤裸鼠的作用。 方法：20只裸鼠利用前述建模方法建立表达红色荧光的裸鼠骨肉瘤原位模型，80%裸鼠模型确定成瘤后分组，以每组5只随机分为四组，阴性对照组（生理盐水组）5只，实验组单用贝伐单抗（5mg/kg）治疗组，实验组顺铂（5mg/kg）治疗组组5只，实验组顺铂联合贝伐单抗治疗组5只（贝伐单抗5mg/kg+顺铂5mg/kg），给药方式均为腹腔内注射，隔日进行活体荧光成像仪下活体荧光成像取得实验数据，荷瘤裸鼠给药3周后停止给药，自然观察动物直至荷瘤鼠全部自然死亡，统计不同干预方法下的生存期并进行分析。 结果：单用贝伐单抗治疗组的平均生存期对比对照组延长约30天，因此提示贝伐单抗有可能改善荷瘤鼠的一般状况，从而延长生存时间；通过整个实验过程中荷瘤裸鼠的体重和身体状况的分析，可以提示阴性对照组、各剂量的治疗组的没有表现出明显的药物副作用和毒性；而使用顺铂的治疗组在给药后死亡出现较早，说明5mg/kg剂量的顺铂对动物有明显的毒性作用。各组之间肺转移率无明显差异。 结论：单独使用及联合使用顺铂对裸鼠的毒性作用大，使用贝伐单抗各剂量治疗组对骨肉瘤的抑制及对裸鼠肺转移抑制作用不明确，对荷瘤裸鼠的生存期具有明显延长作用，但是相关原因及机制尚待进一步深入研究。

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