胰高血糖素样肽-1受体激动剂和脐带间充质干细胞对2型糖尿病糖代谢及胰岛β细胞功能的作用

摘要

目的:
　　1、探讨胰高血糖素样肽-1受体激动剂利拉鲁肽或脐带间充质干细胞单用及联用对高糖高脂饲料喂养及腹腔注射小剂量STZ方法诱导的2型糖尿病SD大鼠糖代谢和胰岛β细胞功能的作用及其与炎症信号调控通路机制间的关系。
　　2、设计前瞻性小样本临床研究:为期24周、随机、单盲、对照探讨对利拉鲁肽疗效欠佳的2型糖尿病患者联合脐带间充质干细胞移植治疗对其糖代谢及胰岛β细胞功能的作用。
　　方法:
　　1、以SD大鼠为对象，采用高糖高脂喂养4周再联合腹腔注射30mg/kg STZ的方法制备2型糖尿病模型，检测连续两次空腹血糖大等于11.1 mmol/L可以判断为2型糖尿病合格模型大鼠。按照随机数字表的方法将2型糖尿病模型大鼠分为4组:A组（DM对照组，DM组）;B组（脐带间充质干细胞治疗组，hUC-MSCs组）;C组（利拉鲁肽治疗组，LIRA组）;D组（利拉鲁肽和脐带间充质干细胞联合治疗组，LIRA+hUC-MSCs组）。各组鼠数均为10只。分别给予相应的药物干预治疗持续8周，各组具体用药方案如下。对照组:尾静脉注射不含有脐带间充质干细胞的培养液100ul;皮下注射生理盐水2ml，每日两次。脐带间充质干细胞治疗组:尾静脉注射含有脐带间充质干细胞的培养液100ul（细胞数目5×106）;皮下注射生理盐水2ml，每日两次。利拉鲁肽治疗组:尾静脉注射不含有脐带间充质干细胞的培养液100ul;皮下注射利拉鲁肽200ug/kg稀释液2ml，每日两次。利拉鲁肽和脐带间充质干细胞联合治疗组:尾静脉注射含有脐带间充质干细胞的培养液100ul（细胞数目5×106）;皮下注射利拉鲁肽200ug/kg稀释液2ml，每日两次。实验观察检测指标为各组实验大鼠一般状况;大鼠血清的空腹血糖、糖化血红蛋白、血清C肽、胰高血糖素、胰高血糖素样肽1、胃泌素及胆囊收缩素浓度;大鼠胰腺组织病理学变化，免疫组织化学方法检测胰岛素和胰高血糖素的表达;TUNEL法检测胰岛细胞凋亡;荧光定量PCR检测胰腺组织的NF-κB、TLR4 mRNA的表达。
　　2、采用随机、单盲、对照的前瞻性临床研究方法。筛选合格受试者:符合1999年WHO的2型糖尿病诊断标准且病程大于10年，在服用促泌剂、二甲双胍两种口服降糖药并联合预混或基础胰岛素类似物治疗（促泌剂日剂量达药物最大推荐用量，二甲双胍日剂量达1000mg，胰岛素日剂量达20单位）的基础上并已加用胰高血糖素样肽-1受体激动剂利拉鲁肽每日睡前皮下注射1.2mg治疗，而且药物剂量稳定并维持用量至少6个月，但糖化血红蛋白控制仍未达标（7％≤HbA1c≤10％）。12例合格受试者签署临床研究知情同意书，按照随机数字表法进行随机分组:A组（利拉鲁肽联合脐带间充质干细胞假移植治疗组，LIRA-hUC-MSCs组）和B组（利拉鲁肽联合脐带间充质干细胞移植治疗组，LIRA+hUC-MSCs组）两组。每组患者例数均为6例。两组干预方案为:利拉鲁肽用量仍为1.2mg，每天睡前皮下注射，干预24周。脐带间充质干细胞移植方法:随机第1天在干细胞影像介入室进行介入下胰腺动脉输注脐带间充质干细胞移植(细胞量为1×106/kg);随机第8天、第15天和第22天在干细胞外周静脉治疗室分别进行外周静脉输注脐带间充质干细胞移植(每次细胞量为1×106/kg)。脐带间充质干细胞假移植方法:随机第1天在干细胞影像介入室进行股动脉穿刺输注等体积生理盐水;随机第8天、第15天和第22天在干细胞外周静脉治疗室分别进行外周静脉输注等体积生理盐水。研究期间定期监测患者一般情况、空腹血糖和糖化血红蛋白;行75克口服葡萄糖耐量试验及C肽释放试验评价早相C肽分泌功能(△Cp30/△G30)、C肽分泌总量（C肽180min曲线下面积，AUCCP180）和稳态模型法评估的胰岛素抵抗指数(HOMA-IR=FIns×FPG/22.5)。
　　结果:
　　1、随机分组治疗前，各组大鼠空腹血糖和糖化血红蛋白比较无明显差异，具有组间基线可比性。分组治疗8周末，与糖尿病对照组比较，三个治疗组大鼠空腹血糖和糖化血红蛋白均呈明显降低;与脐带间充质干细胞治疗组相比较，利拉鲁肽治疗组以及利拉鲁肽和脐带间充质干细胞联合治疗组两组糖化血红蛋白水平降低更明显;进一步比较利拉鲁肽治疗组以及利拉鲁肽和脐带间充质干细胞联合治疗组两组糖化血红蛋白，提示利拉鲁肽和脐带间充质干细胞联合治疗组大鼠糖化血红蛋白明显低于利拉鲁肽治疗组，差异具有统计学意义。
　　2、随机分组治疗8周末对各组大鼠空腹血清进行C肽、胰高血糖素、胰高血糖素样肽-1、胃泌素及胆囊收缩素各激素水平检测，结果提示:与糖尿病对照组比较，脐带间充质干细胞治疗组C肽明显升高，胰高血糖素、胰高血糖素样肽-1、胃泌素和胆囊收缩素差异无统计学意义;利拉鲁肽治疗组以及利拉鲁肽和脐带间充质干细胞联合治疗组C肽、胰高糖素样肽-1、胃泌素和胆囊收缩素水平均明显升高，胰高血糖素的水平降低。与脐带间充质干细胞治疗组比较，利拉鲁肽治疗组以及利拉鲁肽和脐带间充质干细胞联合治疗组C肽、胰高血糖素样肽-1均明显升高，胰高血糖素的水平降低;与利拉鲁肽治疗组比较，利拉鲁肽和脐带间充质干细胞联合治疗组C肽和胰高血糖素样肽-1明显升高，胰高血糖素明显降低，胃泌素和胆囊收缩素水平差异无统计学意义。
　　3、随机分组治疗8周末，胰腺组织HE染色形态比较，提示在微镜下糖尿病对照组大鼠胰腺组织形态紊乱，仅见少量胰岛细胞团存在;而三个治疗组大鼠胰腺组织胰岛形态呈现明显改善，可见较多胰岛细胞团，细胞间排列较紧密，边界清楚，胞浆丰富;微镜下观察三个治疗组胰岛形态结构未见明显差异。进一步行免疫组化，就可以观察到相比较于单用利拉鲁肽治疗组或脐带间充质干细胞治疗组，利拉鲁肽和脐带间充质干细胞联合治疗组大鼠胰腺组织中胰岛素阳性面积占胰岛总面积百分比明显增高，而胰高血糖素表达明显降低。采用TUNEL染色进行检测大鼠胰腺组织胰岛细胞凋亡，也观察到相比较于单用利拉鲁肽治疗组或脐带间充质干细胞治疗组，利拉鲁肽和脐带间充质干细胞联合治疗组大鼠胰岛细胞凋亡明显减轻，而且胰腺组织NF-κB和TLR4基因表达亦明显降低。
　　4、共纳入合格受试者12例，随机分为利拉鲁肽联合脐带间充质干细胞假移植治疗组和利拉鲁肽联合脐带间充质干细胞移植治疗组两组，每组各6例，所有患者均按方案完成临床研究。
　　5、两组患者基线时的体重、体重指数、腰围、收缩压及舒张压等一般情况比较差异无统计学意义，具有可比性。治疗24周末，与治疗前比较两组患者的一般情况亦未见差异具有统计学意义。
　　6、两组患者基线时的空腹血糖、餐后2h血糖及糖化血红蛋白比较差异无统计学意义，具有可比性。与治疗基线时比较，治疗24周末利拉鲁肽联合脐带间充质干细胞假移植治疗组空腹血糖、餐后2h血糖及糖化血红蛋白的差异无统计学意义;与治疗基线时比较，治疗24周末利拉鲁肽联合脐带间充质干细胞移植治疗组空腹血糖、餐后2h血糖及糖化血红蛋白均呈明显降低，差异具有统计学意义;治疗24周末，与利拉鲁肽联合脐带间充质干细胞假移植治疗组比较，利拉鲁肽联合脐带间充质干细胞移植治疗组空腹血糖、餐后2h血糖及糖化血红蛋白明显降低。
　　7、两组患者基线时的早相C肽分泌(△Cp30/△G30)、C肽分泌总量(AUCCP180)及胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)比较差异无统计学意义，具有可比性。与治疗基线时比较，治疗24周末利拉鲁肽联合脐带间充质干细胞假移植治疗组△Cp30/△G30、AUCCP180及HOMA-IR的差异无统计学意义;与治疗基线时比较，治疗24周末利拉鲁肽联合脐带间充质干细胞移植治疗组△Cp30/△G30和AUCCP180均呈明显上升，而HOMA-IR呈明显降低，差异具有统计学意义;治疗24周末，与利拉鲁肽联合脐带间充质干细胞假移植治疗组比较，利拉鲁肽联合脐带间充质干细胞移植治疗组△Cp30/△G30和AUCCP180均呈明显上升，而HOMA-IR呈明显降低，差异具有统计学意义。
　　结论:
　　1、与胰高血糖素样肽-1受体激动剂利拉鲁肽或脐带间充质干细胞单用相比较，两种方法联用对高糖高脂饲料喂养及小剂量STZ腹腔注射方法诱导的2型糖尿病SD大鼠具有更好地恢复胰岛结构和改善胰岛功能，包括胰腺组织胰岛病理形态紊乱明显好转、免疫组化显示胰腺组织中胰岛素表达增多而胰高血糖素表达降低，TUNEL染色结果同样显示胰岛细胞凋亡减轻，从而有效地促进C肽分泌、抑制胰高血糖素分泌，同时改善了胃肠激素胰高血糖素样肽-1的分泌，以达到良好的控制糖尿病大鼠血糖和糖化血红蛋白的作用。利拉鲁肽和脐带间充质干细胞联合干预对糖尿病大鼠糖代谢的改善作用机制与其下调了TLR4/NF-κB炎症信号通路密切相关。
　　2、为期24周、随机、单盲、对照的前瞻性小样本临床研究结果显示对利拉鲁肽疗效欠佳的2型糖尿病患者联合脐带间充质干细胞移植具有更好地改善患者胰岛功能包括提高胰岛早相C肽分泌、C肽分泌总量及提高胰岛素敏感性，从而实现糖尿病患者血糖和糖化血红蛋白的良好控制。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

第一部分 GLP-1受体激动剂和脐带间充质干细胞联合治疗对2型糖尿病大鼠糖代谢及胰岛β细胞功能的作用

引言

材料与方法

结果

讨论

第二部分 GLP-1受体激动剂和脐带间充质干细胞联合治疗对2型糖尿病患者糖代谢及胰岛β细胞功能的作用

引言

对象与方法

结果

讨论

全文结论

参考文献

综述 肠道特异性菌群——胰高血糖素样肽-1——糖尿病

在读期间发表的论文

致谢