胰高血糖素样肽-1受体激动剂对糖耐量减低大鼠胰岛α细胞超微结构作用的研究

摘要

目的：通过比较糖耐量正常(NGT)大鼠和胰高血糖素样肽-1(GLP-1)受体激动剂艾塞那肽(Exendin-4)干预高糖高脂饲养诱导的糖耐量减低(IGT) Wistar大鼠胰岛α细胞超微结构的变化和血清胰高血糖素的表达，探讨Exendin-4对IGT大鼠胰岛α细胞超微结构的改善作用及对胰岛α细胞功能调节的可能机制。
　　 方法：54只4～5周龄(150g-170g)雄性Wistar洁净大鼠，购于山西医科大学动物中心。适应饲养7天（5只/笼），随机分组:A组（常规饲养，n=18）和B组（高糖、脂饲养，n=36）。其中A组给予常规饲料饲养（13.4kJ/g，其中脂肪供热量为10.2％，蛋白质供热量为23.3％，碳水化合物供热量为66.5％）; B组给予高糖、脂饲料喂养(21.8kJ/g，其中脂肪供热量为56.0％，蛋白质供热量为7.0％，碳水化合物提供热量为37.0％)，所以大鼠均不限制饮水，室内温度控制在18-22℃，室内湿度控制在30％-70％，每组大鼠于早晚分别投食一次，每只大鼠每日的投食量为其体重的3％。同组大鼠的体重相差不大于10％，两组动物体重相差不大于5％。喂养至12周时，行糖耐量实验(OGTT)试验:禁食8h后，行鼠尾部位采血，用强生血糖仪检测其空腹血糖(FBG)，然后用高糖（50％葡萄糖）2g/kg体重进行灌胃，2h后再次对鼠尾进行采血，测其2h血糖(2hPG)值。以7.8mmol/l≤2hPG＜11.1 mmol/l并持续一周以上为造模成功[1]。经检测，常规饲养组Wistar大鼠血糖值均正常，全部纳入糖耐量正常对照组(NGT组，n=18)，仍予以常规饲料饲养，饮水不限;B组Wistar大鼠造模成功率88％，为32只。然后将B组Wistar大鼠随机分为对IGT对照组(n=16)和Ex干预组(n=16)，仍予以高糖、脂饲料投食，饮水不限。喂养7天后，随机分别抽取各组大鼠1/2数量，行糖耐量试验，用强生快速血糖仪检测空腹血糖及2h血糖。于次日禁食14h后，用5％水合氯醛0.6ml/100g行大鼠腹腔麻醉，腹主静脉部位采血，采取血清标本后迅速离心，血清置于-70℃冰箱保存，用放射免疫检测法检测血清胰高血糖素(Glucagon)。迅速取胰尾组织，切成1立方毫米小块，放入2％的戊二醛（1-4h）固定，用1％四氧化锇后固定，丙酮系列脱水，环氧树脂618包埋，电镜观察以确定组织块中含有胰岛，制作超薄切片(50hm)，切片经醋酸铀和柠檬酸铅电子染色后，在日本电子JEM-1011型透射电子显微镜观察并切片，观察胰岛α细胞胞质内分泌颗粒、线粒体、粗面内质网等变化。剩余1/2数量大鼠Ex组给予Exendin-4（礼来公司生产）5ug/kg腹部皮下注射，每日两次。NGT组和IGT组均给予等体积生理盐水皮下注射，于干预4周后全部处死，行以上指标检测。
　　 所有计量资料均采用均数±标准差((x)±s)表示，采用SPSS13.0统计软件，各组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，LSD检验，以P≤0.05为差异有统计学意义。
　　 结果：
　　 1.各组大鼠空腹血糖和餐后2小时血糖比较如下:干预前，FBG: NGTvs.IGT(4.79±0.55vs.5.05±0.72),NGTvs.Ex:(4.79±0.55vs.5.23±0.39),P均大于0.05,差异无统计学意义;IGTvs.Ex（5.05±0.72vs.5.23±0.39），P＜0.05，差异无统计学意义;Ex前vs.Ex:（5.05±0.72vs.4.89±0.313），P＞0.05，差异无统计学意义。2hPG: NGTvs.IGT(5.96±0.77vs.9.69±0.33),NGTvs.Ex(5.96±0.77vs.9.26±0.38),均P＜0.05，差异均有统计学意义;IGTvs.Ex(9.69±0.33vs.9.28±0.38)，P＜0.05,差异无统计学意义。Exendin-4干预4周后，FBG: Ex vs.IGT(4.98±0.36vs.4.89±0.31)，P＞0.05，差异无统计学意义。2hPG: Ex vs.IGT（10.28±0.38vs.7.19±0.34），P＜0.05差异有统计学意义。Ex前vs.Ex后FBG:（5.05±0.72vs.4.89±0.313），P＞0.05，差异无统计学意义。Ex前vs.Ex后2hPG:（9.28±0.38vs.7.19±0.34），P＜0.05，差异有统计学意义。与NGT组比较，上述各项指标差异均无统计学意义(4.93±0.39vs.4.89±0.31)（6.26±0.53vs.7.19±0.3），（均P＞0.05）。
　　 2.各组大鼠胰腺组织透射电镜结果:取胰尾组织，制作超薄切片(50nm)，在日本电子JEM-1011型透射电子显微镜观察并切片，可看到:NGT组大鼠胰岛α细胞内含带晕环的分泌颗粒，且颗粒饱满，较大，内有电子密度高的致密芯，芯为圆形，细胞核圆居基底中央，核膜清晰，核染色质及内容物分布均匀，细胞内线粒体、内质网排列紧密、整齐。IGT组胰岛α细胞胞质内分泌颗粒数量增多，可见致密芯与界膜间的间隙变窄，有的消失;线粒体肿胀变形，排列不规则，细胞核膜皱缩、边界凹凸不平，核染色质固缩，内质网排列不规则，弥散分布于细胞，线粒体密度降低，嵴变短浅，内质网上基粒不清晰、脱落，细胞器结构未见明显改变。Exendin-4组胰岛α细胞胞质内分泌颗粒数量减少，致密芯与界膜间的间隙较IGT组变宽，线粒体减少。
　　 3.胰岛α细胞胞质内分泌颗粒数量变化:标本均在日本电子JEM-1011型透射电子显微镜下观察和摄片，每一标本随机选取5个视野，每组计数50个α细胞，计数每个α细胞胞质内的分泌颗粒数量，取其平均值来代表每组中胰岛α细胞胞质内的分泌颗粒数量。干预前，IGT组、Ex组的大鼠胰岛α细胞分泌颗粒水平较NGT组均升高(74.60±6.55vs.135.32±16.31)(74.60±6.55vs.129.64±12.78)，差异均有统计学意义(均P＜0.05)。与IGT组比较，Ex组的大鼠胰岛α细胞分泌颗粒差异无统计学意义(135.32±16.31vs.129.64±12.78)(P＞0.05)。Exendin-4干预4周后，与同期IGT组比较，Ex组的大鼠胰岛α细胞分泌颗粒水平降低（75.79±8.23vs.135.32±16.31），差异有统计学意义(P＜0.05)。与干预前Ex组比较降低（75.79±6.55vs.129.64±12.78），差异有统计学意义(P＜0.05)。与NGT组比较差异无统计学意义（75.79±8.23vs.74.60±6.55）(P＞0.05)。
　　 4.各组大鼠血清胰高血糖素水平比较:干预前大鼠胰高血糖素水平比较:NGT组vs.IGT组(88.18±6.94vs.118.89±3.53)，NGTvs.Ex组（88.18±6.94vs.116.12±3.37），P＜0.05，差异有统计学意义。IGT组vs.Ex组(118.89±3.53vs.116.12±3.37)，P＞0.05，差异无统计学意义。Exendin-4干预4周后大鼠胰高血糖素水平比较，IGT组vs.Ex组(118.39±4.36vs.86.89±6.23)，P＜0.05差异有统计学意义。Ex前vs.Ex后（116.12±3.37vs.86.89±6.23），P＜0.05，差异有统计学意义。NGT组vs.Ex组（88.07±7.34vs.86.89±6.23），P＞0.05，差异无统计学意义。
　　 结论：
　　 1.糖耐量减低阶段已出现胰岛α细胞超微结构的变化，胰岛α细胞胞质内分泌颗粒增多，线粒体变形、增多紊乱，粗面内质网增多，胰岛α分泌功能增强，胰高血糖素合成和分泌增多，证实此阶段胰岛α细胞超微结构的变化可能导致的胰岛α细胞分泌功能的增强参与了糖代谢紊乱的过程，提示胰岛α细胞超微结构的变化和分泌功能的增强可能为糖耐量减低的发病机制之一。
　　 2.在糖耐量减低阶段，胰高血糖素的分泌增加，使血糖进一步升高，与胰岛α细胞合成和分泌功能增强有关。
　　 3.GLP-1受体激动剂Exendin-4可以减少糖耐量减低大鼠胰岛α细胞胞质分泌颗粒、线粒体的增多、粗面内质网的增多，能够降低胰高血糖素的分泌，其可能通过改善胰岛α细胞的超微结构的同时抑制胰岛α细胞的分泌功能，使胰高血糖素过度分泌降低，将成为延缓或阻止IGT进展的靶点之一。

目录

声明

摘要

英文缩略词对照表

前言

材料与方法

1 主要试剂及仪器

2 动物分组与模型制备

3 标本的采集

4 各项指标的检测

5 统计学分析

结果

1．不同组大鼠PBG和2hPBG指标

2．各组大鼠胰岛α细胞的超微结构的变化

3．干预前后各组大鼠胰岛α细胞胞质内分泌颗粒的变化

4．各组大鼠血清胰高血糖素水平比较

讨论

1．糖尿病减低阶段胰岛α细胞超微结构和分泌功能的变化

2．GLP-1受体激动剂对糖耐量减低大鼠胰岛α细胞的作用

结论

参考文献

综述

攻读学位期间发表论文情况

致谢

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