烟酰胺N甲基转移酶NNMT表观遗传调控促进胶质瘤增殖侵袭的作用⽤机制研究

摘要

脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤之一，约占全部脑肿瘤的45～55%。目前，脑胶质瘤的治疗手段主要包括手术治疗、放射治疗、化学治疗等，但由于肿瘤呈浸润性生长，与周围脑组织无?明显分界且易于复发，上述传统治疗措施疗效均不甚理想。新的治疗手段如基因治疗等虽有望成为治愈胶质瘤的途径之一，但目前仍缺乏理想可靠的治疗靶标。 因此寻找调控胶质瘤细胞恶性生物学行为的分子靶标，明确其在胶质瘤发病过程中的病理机理，已成为神经科学领域的研究热点之一。烟酰胺N-甲基转移酶NNMT是一种S-腺苷基-L-甲硫氨酸依赖性细胞质酶，催化烟酰胺及其它嘧啶的N-甲基单元，形成吡啶离子。NNMT在肝脏组织中有明显的表达，而在肾脏、肺脏、骨骼肌、胎盘、心脏等很少表达，在脑组织中低表达或不表达。 目前研究发现，NNMT在多种肿瘤组织中异常表达，包括：胃腺癌、甲状腺乳头状癌、结肠癌、肝细胞癌、肺癌、胰腺癌等。在非肿瘤性病变中，NNMT被发现在慢性阻塞性肺疾病COPD、动脉粥样硬化、以及帕金森病中异常表达。NNMT参与肿瘤的代谢、甲基化、氧化应激反应，被认为在肿瘤的发生、发展中产生重要作用，但其具体机制尚不清楚。 Kristian Ovaska等通过大数据框架整合技术Anduril，整合大规模分子及临床数据，分析筛选出一组与GBM增殖、生存以及多形性密切相关的基因改变，NNMT基因便是其中之一，初步发现在体外细胞中下调NNMT的表达可以显著抑制GBM的增殖，提示NNMT可能在胶质瘤的恶性生物学行为中扮演重要角色，但具体机制尚无研究。 我们将从以下几个方面对NNMT在胶质瘤中的作用做系统的研究：制备了59例经手术切除的胶质瘤标本组织芯片，通过Western blot检测不同级别脑胶质瘤中NNMT的表达水平。制作生存曲线，观察NNMT表达水平与患者生存时间的关系。接着，进行体外细胞学实验，通过慢病毒敲减胶质瘤细胞系中NNMT的表达，检测其对胶质瘤细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡等细胞恶性成为学行为的影响。 通过成球实验，观察NNMT对胶质瘤干性的影响。随后，进行差异基因表达谱芯片检测，筛选NNMT基因下游靶标基因。由于NNMT是甲基化调控酶，我们还将进行甲基化检测，阐明NNMT甲基化调控靶标。最后，对NNMT调控下游靶标的方式做出初步研究，从而阐明NNMT促进胶质瘤增殖、侵袭的作用机制。本实验将分四个部分进行：1.NNMT在人脑胶质瘤中的表达及临床意义；2.NNMT对胶质瘤增殖、侵袭、凋亡等细胞功能及干性的影响；3.NNMT在胶质瘤中的下游靶标筛选及验证；4.NNMT是否通过表观遗传调控促进价胶质瘤增殖侵袭。 第一部分 NNMT在人脑胶质瘤中的表达及临床意义 目的：探讨NNMT在胶质瘤中的表达情况及临床意义 内容：对59例经手术切除的胶质瘤标本制作组织芯片，免疫组织化学检测NNMT在不同级别胶质瘤中的表达情况，同时对患者的随访资料进行分析，分析NNMT在不同级别胶质瘤中的表达情况与生存时间的关系，制作生存曲线。 结果：NNMT在胶质瘤中过表达，其表对水平随着病理级别的增加而增加，与胶质瘤患者生存时间负相关，NNMT表达高的患者，生存时间缩短。 结论：NNMT在人脑胶质瘤中过表达，表达水平与胶质瘤恶性程度正相关，与生存时间负相关，NNMT与胶质瘤的恶性行为相关。 第二部分 NNMT对胶质瘤增殖、侵袭、凋亡等细胞功能及干性的影响 目的：体外细胞学实验研究NNMT对胶质瘤细胞系增殖、迁移、侵袭、凋亡等细胞功能及成球能力等干性的影响 内容：构建经慢病毒转染SiRNA敲减NNMT的U87、U251细胞系，同时设立空白对照组，筛选稳转细胞株。Western blot验证慢病毒敲减效果，WST1法检测细胞增殖，划痕法检测细胞迁移，Transwell法检测细胞侵袭，流式细胞仪检测细胞凋亡，成球检测NNMT对干性的影响。 结果：慢病毒转染SiRNA敲减NNMT后，U87、U251胶质瘤细胞的增殖、迁移、侵袭能力明显下降，成球能力下降，凋亡增加。 结论：慢病毒转染SiRNA敲减NNMT在U87、U251胶质瘤细胞中的表达，能抑制胶质瘤细胞的增殖、迁移、凋亡等恶性表型，同时抑制成球能力（干性），并促进肿瘤细胞凋亡。 第三部分 NNMT在胶质瘤中的下游靶标筛选及验证 目的：筛选NNMT促进胶质瘤细胞增殖、侵袭等恶性生物学行为的下游靶标基因。 内容：构建慢病毒转染SiRNA敲减U251细胞系两组（U251-KD1,U251-KD2），同时设立空白对照组，筛选稳转细胞株。用基因表达谱芯片筛选下游靶标基因。对筛选出的基因进行作用分析，挑选感兴趣基因。PCR及Western Blot验证靶标基因。 结果：U251-KD1和U251-KD2两个NNMT敲减细胞系和U251-NC对比，进行基因表达谱芯片分析，筛选出共同下调的基因共61个下调和32上调基因，进一步分析挑选出感兴趣的8个下调基因MMP2、MMP7、RSPO3、SEMA3F、TNFRSF19、ANXA8、APOBEC3G、CXCR7，这8个基因与肿瘤的增殖、侵袭密切相关。同时挑选出5个上调基因PAK3、GAP43、ELAVL2、NEGR1、STAU2，这五个基因具有不同途径的抑癌作用。对筛选出的靶标基因进行PCR验证，PCR结果与基因表达谱芯片筛选出的结果一致。 结论：NNMT在U251胶质瘤细胞中的下游上调靶标基因MMP2、MMP7、RSPO3、SEMA3F、TNFRSF19、ANXA8、APOBEC3G、CXCR7等主要与增殖、侵袭、迁移相关，下游下调靶标主要与PAK3、GAP43、ELAVL2、NEGR1、STAU2抑癌相关。 第四部分 NNMT是否通表观遗传调控促进胶质瘤增殖侵袭 目的：初步探讨NNMT是否通过调控GAP-43促进胶质瘤的增殖、侵袭和凋亡。 内容：构建慢病毒转染SiRNA敲减NNMT U251细胞系两组（U251-KD1,U251－KD2），同时设立空白对照组，筛选稳转细胞株。用甲基化芯片筛选下游作用靶标。对筛选出的基因进行文献学习，挑选感兴趣基因。 结果：慢病毒转染SiRNA敲减NNMT U251细胞系两组（U251-KD1,U251－KD2），引起GAP-43的多个甲基化位点发生变化，GAP-43也是我们在基因表达谱芯片中筛选出的靶标基因。 结论：NNMT促进胶质瘤增殖、侵袭的一个下游靶标是GAP-43，其作用可能是通过甲基化调控实现的。

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