靶向肺癌标记物Mesothelin的嵌合抗原受体T细胞体内体外抗肿瘤活性研究

摘要

肺癌发病率高，每年因肺癌死亡的人数常居所有恶性肿瘤之首，但因其病情隐匿，超过80%患者就诊时已经是肺癌晚期，丧失了手术机会。同时，肺癌又是一种免疫原性较弱的恶性肿瘤，在癌细胞进化过程中人类白细胞抗原（HLA-1）的表达减少甚至缺失，因而不被树突状细胞有效识别而逃逸机体免疫系统攻击。因此，寻找有效的治疗手段成为亟待解决的难题。 近年来，利用嵌合抗原受体（chimeric antigen receptors,CARs）通过基因工程改造的T淋巴细胞进行的过继性细胞免疫疗法在肿瘤治疗研究，尤其是血液系统肿瘤治疗研究中取得了突破性进展，但对实体瘤的研究由于对已知靶点的抗原知之尚少而相对滞后。与其它常规的肿瘤免疫治疗方法相比，CAR-T治疗的效应T细胞的靶向性、杀伤性和活力都相对较高，同时还能打破肿瘤病灶部位微环境的免疫抑制以及缓解宿主的免疫耐受。CAR修饰赋予T细胞含有特定抗原的受体，允许T细胞靶向攻击潜在的任何肿瘤。随着重组DNA技术的不断发展以及对信号传导通路研究的不断深入，CAR分子的信号域也从刚开始第一代的单一靶向信号发展为包含CD28、CD137（4-1BB）、CD134（OX40）和ICOS等共刺激分子的多信号区域的二代、三代。近年来，CAR-T技术在包括肺癌在内的多种癌症的临床应用中显示出一定的抗肿瘤效果，特别是在白血病、淋巴瘤、黑色素瘤等恶性肿瘤的控制方面显示出较好的治疗优势。但是，与其它肿瘤免疫治疗一样，CAR-T治疗也存在一些问题与不足，包括脱靶效应，以及基因工程手段将重组CAR分子导入淋巴细胞所致的插入突变等风险。因此，寻找肿瘤细胞更特异的表面抗原、研发安全有效的转导技术等成为完善CAR-T技术的关键所在。 肿瘤相关抗原－间皮素（Mesothelin，MSLN），一种由71-kDa的前体成熟转变成的40-kDa糖基磷脂酰肌醇锚定糖蛋白，存在于细胞表面。MSLN在间皮瘤、非小细胞肺癌、食道癌和和转移性三阴性乳腺癌等多种肿瘤组织中高表达，在正常组织中不表达或间皮组织中低表达，而成为备受关注的肿瘤细胞特异靶向抗原。且有研究报道MSLN可促进肿瘤恶性表型形成，MSLN阳性的患者肿瘤预后更差。此外，在正常胸膜，腹膜，心包膜等间皮组织中MSLN的表达较少，因此以间皮素为靶点来构建CAR-T为免疫细胞治疗提供了一个安全的选择。将MSLN作为肿瘤特异性抗原进行靶向治疗不仅限于CAR-T治疗这一种肿瘤免疫疗法，还有靶向MSLN的免疫重组抗毒素SS1P、结合到抗MSLN的抗体单链可变区和人的IgG1及к恒定区的嵌合单克隆抗体MORAb-009、结合MSLN的一个有效的DNA烷化剂MDX-1382（Medarex）等多种疗法。MSLN已经被证实在约30%-70%的肺癌组织中高表达。因此，MSLN可以作为靶标应用于肺癌的肿瘤免疫治疗中。 基于国内外肺癌免疫治疗的研究现状，由于MSLN作为肿瘤抗原有其独特的优越性，研究靶向MSLN的嵌合抗原受体T细胞体内外抗肿瘤活性。采用基因工程的手段将靶向MSLN的鼠源抗体的可变区联合共刺激分子4-1BB及CD28的三代CARs分子载入到慢病毒体系，用构建成功的慢病毒感染分选出的T细胞，同时以未感染的T细胞为对照，通过流式实验检测重组CAR-T细胞表面MSLN CAR的表达，通过体外检测CAR-T对过表达MSLN肿瘤细胞株Hela细胞的杀伤能力确定重组CAR-T对MSLN靶向的能力。此外，构建了CHO-K1-Mesothelin重组细胞株，使CHO细胞表面过表达人源化的MSLN，模拟重组CAR-T对肿瘤细胞表面的MSLN靶向研究，同样也发现重组CAR-T对CHO-K1-Mesothelin重组细胞株有显著的杀伤能力，进一步验证了重组CAR-T靶向MSLN的能力。最后，将肺癌组织在免疫缺陷NPG小鼠中构建PDX模型，经尾静脉注射重组CAR-T细胞和正常T细胞检测重组CAR-T细胞体内杀伤肿瘤的能力，通过测量肿瘤体积变化判定重组CAR-T细胞对肿瘤的杀伤情况，结果发现在回输之后的10天内，瘤组织的生长受到明显抑制，瘤体积显著小于对照组，说明重组CAR-T细胞在回输10天内抑制了肺癌的发展，可有效杀伤肺癌细胞。 综上所述，通过本实验研究，明确了具有靶向肿瘤特异抗原MSLN的重组CAR-T细胞能在体外杀伤过表达MSLN的肿瘤细胞，同时在小鼠的PDX肺癌模型中证实重组CAR-T细胞能控制肺癌的发展，降低肿瘤体积的增长。这些前期的体外实验以及体内的动物模型实验将为CAR-T技术在临床上应用于过表达MSLN的肺癌提供理论基础。

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