补体应答基因32(RGC-32)对肺腺癌细胞A549恶性行为的影响及相关分子机制研究

摘要

目的: 肺癌是世界上最常见且致命的恶性肿瘤，每年因肺癌而死亡的人数约140万。非小细胞肺癌（NSCLC）是肺癌的主要类型，约占发病率的80%-85%。尽管经过积极的手术治疗以及术后辅助化疗，肺癌患者的5年生存率仍然低于15%，临床研究表明，超过70%的非小细胞肺癌患者出现淋巴结转移。作为一种恶性肿瘤，肺癌，尤其是非小细胞肺癌具有极差的预后，接受手术治疗的患者五年生存率极低，且多数于复发后死于癌症转移。因此，阐明肺癌转移的调节机制以及鉴别新的治疗靶点对提高患者生存率具有十分重要的意义。 上皮间质转化（Epithelial-mesenchymal transitions,EMT）是上皮细胞在特定生理或病理条件下逐渐获得间质特性并转化为间质细胞形态的一种现象。在EMT过程中，上皮细胞逐渐失去细胞粘附蛋白如E-cadherin等上皮细胞标志，而获得Fibronectin、N-cadherin、以及Vimentin等间充质细胞标志。EMT不仅参与胚胎形成以及组织纤维化变化，同时在肿瘤转移过程中也是一个重要的早期事件，同时在肿瘤的多种病理过程中均具有重要影响。有证据表明，在肿瘤的侵袭及转移过程中，EMT进程受到频繁的激活。因此，深入理解上皮细胞转化为间质细胞的过程对与阐明肿瘤侵袭及转移的分子机制是必要的。 补体应答基因32（RGC32）最初是从鼠的少突胶质细胞中分离鉴定得到的，被认为是一种细胞周期激活因子，在人体组织中广泛表达，如胎盘、肾脏、胰腺、肝脏、心脏以及脑组织等，但是不包括肺。近来实验证据表明，RGC32的表达及功能在癌症的发生及发展过程中可能存在潜在的作用。特别是，Fosbrink等发现在肺癌组织中存在RGC3的过度表达；但是，在非小细胞肺癌中也观察到启动子甲基化引起的RGC3表观遗传失活。因此，这些研究表明RGC32在肺癌的发生中可能具有复杂的作用，深入探讨其在肺癌细胞中功能机制是十分必要的。 NF-κB信号通路在多种肿瘤发生发展过程中处于激活状态，活化的NF-κB能够调节多种与肿瘤发生发展相关的基因的表达。NF-κB活化后能上调MMP-2和MMP-9的表达，促进肿瘤细胞的浸润和转移，且NF-κB信号通路激活在多种肿瘤中能够调控EMT的发生。研究显示抑制NF-κB活性可能通过p53途径下调VEGF的表达，减少血管新生，抑制肿瘤转移，表明NF-κB可以作为恶性肿瘤治疗的潜在靶点。 本研究中，首次针对RGC32是否通过诱导EMT表型变化促进肺癌细胞转移及侵润进行研究，并尝试阐释该过程是否与NF-κB信号通路的活化有关。 方法: 1、构建pcDNA3.1-RGC32真核重组载体； 2、pcDNA3.1-RGC32重组质粒转染肺腺癌细胞系A549，G418筛选稳转细胞株； 3、Real-time PCR及Western Blot分别检测RGC32mRNA及蛋白表达水平，鉴定稳转细胞系是否筛选成功； 4、细胞划痕实验检测RGC32过表达对A549细胞迁移能力的影响； 5、Transwell小室侵袭实验检测RGC32过表达对A549细胞侵袭能力的影响； 6、显微镜下观察RGC32过表达对A549细胞形态学的影响； 7、Western Blot检测RGC32过表达对A549细胞EMT相关蛋白水平的影响； 8、Western Blot及明胶酶谱检测RGC32过表达对MMPs表达及活性的影响； 9、Western Blot检测RGC32过表达对NF-κB信号通路的影响。 结果: 1、Real-time PCR及Western Blot检测结果显示，与空细胞及空质粒转染组比较，RGC32过表达组mRNA及蛋白表达水平显著上调（P＜0.01），提示RGC32稳转细胞系筛选成功。 2、细胞划痕结果显示，与空细胞及空质粒转染组比较，RGC32过表达组细胞迁移比率显著增加（P＜0.01），提示RGC32能够促进肺腺癌细胞A549体外迁移能力。 3、Transwell实验结果显示，与空细胞及空质粒转染组比较，RGC32过表达组穿过Matrigel所包被聚酯膜的细胞数显著增加（P＜0.01），提示RGC32能够促进肺腺癌细胞A549体外侵袭能力。 4、形态学观察发现，与A549细胞比较，空质粒转染组细胞基本无变化，仍保持为圆形、结构紧密的上皮样形态特征，RGC32过表达组细胞逐渐表现间质细胞形态特征，向长梭形转变，形态不规则，细胞间隙增大 5、进一步Western Blot检测EMT相关标志分子表达变化，结果显示，与空细胞及空质粒转染组比较，RGC32过表达组细胞上皮细胞标志E-cadherin表达显著下调，间质细胞标志Vimentin以及Fibronectin表达显著上调，E-cadherin的负调节因子Snail以及Slug表达显著上调（P＜0.01），提示RGC32通过上调转录因子Snail以及Slug表达负调节E-cadherin的表达，从而在EMT进程的发挥重要作用。 6、基质金属蛋白酶（MMPs）在肿瘤细胞侵袭转移过程中起到重要作用，同时也是EMT的重要标志分子，通过Western Blot及明胶酶谱实验进行验证，结果表明，与空细胞及空质粒转染组比较，RGC32过表达组细胞中MMP2及MMP9蛋白表达水平显著上调，并且酶活性显著增强（P＜0.01）。 7、为验证RGC32诱导EMT的进程是否通过NFκB信号通路起作用，分别对RGC32过表达细胞进行NFκB抑制剂及NFκB siRNA处理，Western Blot检测结果显示，RGC32过表达引起的E-cadherin表达下调受到NFκB抑制剂及NFκB siRNA作用的削弱，提示NFκB参与了RGC32诱导EMT的进程。 结论: 1、RGC32过表达能够促进肺腺癌细胞A549侵袭及转移能力； 2、RGC32过表达能够促进肺腺癌细胞A549EMT转化进程； 3、NFκB信号通路参与了RGC32促进肺腺癌细胞A549EMT转化的过程。

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