骨髓间充质干细胞治疗芥子气中毒的实验研究

摘要

芥子气（sulfur mustard，SM，分子式C4H8Cl2S，化学名二氯二乙硫醚，CAS登记号505-60-2）是一种双功能烃化剂，是糜烂性毒剂的典型代表，也是主要的化学威胁之一。其先后在一战、日本侵华战争及近期的两伊战争等多次冲突中大规模使用，造成了严重的人员伤亡。芥子气结构简单，容易合成，防治困难，易被国内外恐怖分子掌握和利用，造成大量人员伤亡及危害公共安全。据报道近几年伊斯兰国(ISIL)多次在叙利亚和伊拉克使用包括芥子气在内的化学战剂，造成无辜平民的重大伤害。此外，在日军侵华战争遗留的化学武器中，芥子气是主要的化学毒剂之一，对我国人民的健康及环境安全构成重大威胁。因此积极探索芥子气中毒机制，开发有效的防治药物与措施，对国家公共安全、人民群众的健康及环境都具有重大的战略意义。
　　肺是芥子气损伤的主要靶器官之一，急性肺损伤及其继发感染是芥子气早期致死的主要原因。大量研究表明，芥子气导致的肺损伤与炎症、免疫反应和氧化应激有着密切的关系。而近年来研究表明，骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymalstem cells，BMSCs)可以修复多种受损组织，而且在治疗肺损伤的方面也具有较好的应用前景。许多动物模型均证实BMSCs能够改善各种原因所致的肺损伤。BMSCs主要分泌多种可溶性细胞因子、活性分子、抑制性因子等，还可以通过直接抑制T细胞增殖、降低巨噬细胞、DC细胞的活性，从而发挥抗炎、免疫调节及抗氧化的作用。
　　本研究首次将BMSCs用于治疗芥子气中毒，考查了BMSCs对芥子气中毒小鼠生存率的影响;研究了BMSCs对芥子气中毒小鼠肺损伤的改善作用，并从炎症、免疫反应和氧化应激三个方面，初步探讨了其可能的作用机制。
　　一、BMSCs对芥子气中毒小鼠生存率的改善作用
　　本课题采用皮下注射的方式建立芥子气中毒的损伤模型，设置不同梯度染毒浓度，摸索实验剂量，建立了稳定的芥子气实验模型。原代分离培养ICR小鼠BMSCs，根据目前公认的鉴定方法对BMSCs进行鉴定:结果显示细胞高表达间质类细胞的标志分子CD29和CD44，但是不表达造血干细胞的标志分子CD34和CD45;且能够成功诱导分化为成骨细胞、成脂细胞。从而确认我们分离出的细胞正是BMSCs，能够用于后续实验研究。尾静脉注入鉴定后的BMSCs，考察BMSCs移植后对小鼠生存率的影响。芥子气染毒后，连续观察14天，发现BMSCs可以显著提高芥子气中毒小鼠生存率（P＜0.05）。芥子气染毒后，小鼠出现体重下降、厌食、腹泻，眼睑粘连等症状，死亡时间集中在染毒后第6天左右。与SM组比较，BMSCs治疗组的体重下降幅度、腹泻等症状均有所改善。
　　二、BMSCs对芥子气中毒小鼠肺损伤的改善效应
　　建立小鼠染毒模型后，BMSCs经尾静脉注入小鼠体内，我们从芥子气中毒后使用BMSCs前后肺组织损伤变化对比入手，考查BMSCs对肺组织的病理变化、炎性细胞浸润、肺泡灌洗液(BALF)中总蛋白(TP)浓度、肺湿干重比(W/D)的改善情况。HE染色结果显示，BMSCs可以减轻芥子气中毒小鼠肺组织的病理损伤;且与SM组比较，BMSCs组的病理损伤评分降低（P＜0.05）。免疫组化结果显示，BMSCs减少炎性细胞如MPO+中性粒细胞(P＜0.01)、CD68+巨噬细胞(P＜0.01)及CD3+T细胞(P＜0.01)的浸润。同时BMSCs治疗显著降低了芥子气中毒小鼠肺泡灌洗液(BALF)中总蛋白(TP)浓度(P＜0.01)及肺W/D比值(P＜0.05)。综上，BMSCs可有效的减轻芥子气引起的肺组织损伤。
　　三、BMSCs改善芥子气中毒小鼠肺损伤的初步作用机制探讨
　　通过ELISA及荧光定量PCR技术，检测了与芥子气相关的主要炎症因子如TNF-α、IL-1β、IL-10的表达情况。实验发现，与SM组比较，BMSCs可以降低肺组织内促炎因子TNF-α、IL-1β表达量（P＜0.01），提高抑炎因子IL-10表达量（P＜0.01）。进一步免疫组化检测核转录因子NF-κB表达，发现与SM组比较，BMSCs显著下调NF-κB的蛋白表达(P＜0.01)。该结果提示BMSCs减轻芥子气引起的炎症反应可能是通过降低TNF-α、IL-1β表达量，增加IL-10的表达量，且抑制NF-κB激活实现的。液相悬浮芯片技术检测小鼠血清中多个趋化因子的含量变化，结果显示，与SM组比较，BMSCs治疗可降低LIX/CXCL5、IP-10/CXCL10、MCP-1/CCL2、MIP-1β/CCL4、RANTES/CCL5、M-CSF的表达(P＜0.05)，而KC/CXCL1、MIP-2/CXCL2、MIG/CXCL9、MIP-1α/CCL3的表达均无显著性差异，提示BMSCs的免疫调节作用在改善芥子气引起的肺损伤中发挥重要作用。另外，我们检测了肺组织中MDA、SOD、GSH的含量变化，结果显示BMSCs能够显著降低MDA的含量（P＜0.01），而增加SOD、GSH的含量(P＜0.01);且Western Blot检测Nrf-2/HO-1表达，显示BMSCs治疗后可上调Nrf-2/HO-1的表达(P＜0.05)，提示BMSCs抗氧化作用可能与调节Nrf-2/HO-1通路有关。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

第一章 BMSCs对芥子气中毒小鼠生存率的改善作用

一、前言

二、材料和方法

三、实验结果

四、小结与讨论

第二章 BMSCs对芥子气中毒小鼠肺损伤的改善效应

一、前言

二、材料和方法

三、实验结果

四、小结与讨论

第三章 BMSCs改善芥子气中毒小鼠肺损伤的初步作用机制探讨

一、前言

二、材料和方法

三、实验结果

四、小结与讨论

全文总结

参考文献

综述 芥子气中毒的生物治疗方面研究进展

攻读学位期间发表论文及参加科研工作情况说明

致谢