TAM信号通路在原发性胆汁性肝硬化患者中的表达水平及其对巨噬细胞极化的影响

摘要

原发性胆汁性肝硬化(Primary Biliary Cirrhosis，PBC)是机体一类重要的器官特异性的自身免疫性疾病，其主要病理特征为肝脏门管区小叶间胆管上皮细胞发生变性、坏死及炎症细胞浸润引起的肝内小胆管进行性破坏伴门脉炎症性改变，最终导致胆汁淤积，随着病程进展，肝脏发生纤维化，最终演变成肝硬化，肝癌甚至肝衰竭
　　而对于PBC具体的发病机制，当前还不是十分清楚，已知突变的易感基因主要集中于多条免疫信号通路，这些信号通路与免疫细胞功能密切相关如骨髓细胞分化、抗原递程、T细胞分化、B细胞抗体分泌及NK细胞促炎因子的产生等;胆管上皮细胞是PBC肝脏病变的重要靶细胞，胆管上皮细胞损伤是PBC发病机制中重要的一环;研究认为胆管上皮细胞表达的T细胞配体是引起胆管上皮细胞损伤的重要原因，而胆管上皮细胞凋亡新生抗原也被证实与PBC胆管特异性损伤密切相关;此外，胆管上皮细胞还可以行使抗原递程细胞的功能，进一步放大自身炎症免疫损伤。
　　我们应以动态地眼光来探讨PBC特定阶段的发病机制，探寻不同病理阶段潜在的治疗靶点，最终实现对PBC更加针对、更加有效地治疗。
　　基于TAM信号通路、巨噬细胞极化与PBC的潜在联系，我们拟通过本研究探讨二者在PBC中的作用;主要拟解决以下几个问题:第一，探讨TAM受体与配体在包括PBC在内的相关自身免疫性疾病的mRNA表达水平;第二，分析游离的TAM受体家族分子在PBC患者中水平及其临床意义;第三，探讨PBC患者巨噬细胞极化水平的变化以及与Mer受体表达水平的相关性;第四，初步探讨Mer受体在PBC中调控巨噬细胞极化的潜在生物学机制。
　　第一部分 TAM受体家族在自身免疫性疾病中的mRNA表达水平及其临床意义
　　在本部分研究中，我们纳入了原发性胆汁性肝硬化、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、原发性干燥综合症以及健康对照者，使用RT-PCR方法对比分析上述几类自身免疫性疾病患者外周血单个核细胞中TAM受体及其配体的mRNA表达水平并分析其表达水平与患者的临床特征间的相关性;结果显示TAM受体家族分子无论受体还是配体在自身免疫性疾病的外周血单个核细胞中均存在不同程度的异常表达，在类风湿性关节炎患者中Gas6与Tyro-3、Axl呈现显著的低表达水平，在系统性红斑狼疮患者中Gas6、ProteinS、Ax1显著低表达且这种低表达与系统性红斑狼疮患者的疾病严重程度及炎症反应水平密切相关;而在PBC患者中，ProS与Ax1的表达水平显著地降低，但与PBC患者的临床特征无显著相关性;该部分研究结果说明在自身免疫性疾病中TAM受体家族存在不同程度地低表达水平，基于TAM受体信号通路的功能进一步反映该信号通路在自身免疫性疾病发病机制中潜在的作用。
　　第二部分 原发性胆汁性肝硬化患者血清游离TAM受体家族分子水平及其临床意义;
　　本部分研究中，我们检测了原发性胆汁性肝硬化患者血清中游离TAM受体家族分子(sTAM)的浓度水平，发现PBC患者血清中ProS浓度显著降低(102.1±10.0ug/ml vs108.6±5.6ug/ml，p＜0.01)，而sMer、sTyro-3的浓度水平在PBC患者血清中显著的高于健康对照者(21.1±7.5ug/ml vs17.1±2.65ug/ml;8.51±4.0ug/mlvs5.18±1.74ug/ml)，临床相关性分析结果显示:sMer水平与PBC患者的AKP、GGT、TBA水平呈现显著的正相关性(r=0.33，p＜0.01;r=0.65，p＜0.01;r=.73，p＜0.01)，同样，sTyro-3的浓度水平与AKP、GGT、TBA呈现显著的正相关性(r=0.48，p＜0.01;r=0.49，p＜0.01;r=.49，p＜.01)，进而说明在肝功能较差的PBC患者中游离的sMer、sTyro3水平要显著增加;随后的诊断试验显示sTyro-3在PBC中的诊断ROC曲线下面积达到0.77(95％cCI0.69-0.85)，敏感度达0.70，特异度为0.78，其中Cutoff值为6.30ug/ml; sMer的ROC曲线下面积为0.66(95％CI0.56-0.76)，敏感度达0.63，特异度为0.72，其中Cutoff值为17.7ug/ml;ProS的ROC曲线下面积为0.68(95％CI0.59-0.78)，敏感度达0.87，特异度为0.47，其中Cutoff值为103.1ug/ml;由此可见，血清中游离地TAM受体家族分子在PBC的诊断中具有重要地临床意义。
　　第三部分 原发性胆汁性肝硬化患者外周血单核巨噬细胞中TAM膜受体表达水平、巨噬细胞极化情况及二者之间的相关性;
　　在本部分研究中，我们主要分析了原发性胆汁性肝硬化患者外周血单核巨噬细胞极化情况，流式结果显示在早期PBC患者中M1型巨噬细胞(CD68+/CCR2+)的比例要显著高于晚期PBC患者(p＜0.05); M2型巨噬细胞(CD163+/CX3 CR1+)在晚期PBC患者外周血中比例要显著高于早期PBC患者(p＜0.05);由于不同极化类型的巨噬细胞分泌特异性细胞因子，为了进一步验证PBC患者外周血M1与M2型巨噬细胞分布情况，我们检测了TNF-α、IL-12、TGF-β、IL-10的浓度水平;结果显示在早期PBC患者中IL-12水平显著高于晚期PBC患者(129.7±51.3pg/mlvs87.8±23.9pg/ml， p＜0.01)，而TGF-β水平显著低于晚期PBC患者(5384.0±4055.8pg/mlvs14182.8±10894.6pg/ml;p=0.02);由于TNF-α、IL-12为M1型巨噬细胞特异性细胞因子，而TGF-β、IL-10为M2型巨噬细胞特异性细胞因子，进一步证实PBC不同阶段的M1/M2分型情况。此外，本部分使用流式细胞术检测了不同阶段PBC患者与健康对照者外周血单核巨噬细胞群中TAM膜受体(mTAM)表达水平，在早期PBC患者中mMer水平显著低于晚期PBC患者(p＜0.01)，而对于其它两个膜受体mTyro-3、mAx1在早晚期PBC患者中未见明显差异;基于不同阶段PBC患者中M1与M2型巨噬细胞比例以及TAM膜受体表达水平，我们进一步分析了M2/M1比值与mMer、mTyro-3、mAx1的相关性;结果显示mMer与M2/M1比值呈现显著正相关(r=0.57，p＜0.01)，即M2巨噬细胞比例随着mMer表达升高而增加;此外，我们对M2/M1比值与PBC患者的临床特征进行了相关性分析，分析结果显示:M2/M1比值与DBIL、AKP水平呈现正相关性(r=081，p＜0.01; r=0.71，p＜0.01)，即PBC患者血清中DBIL、AKP水平随着外周血M2/M1比值的升高而增加;本部分研究证实PBC患者外周血中巨噬细胞极化情况与mMer水平密切相关。
　　第四部分 初步探讨Mer对巨噬细胞极化的调节作用及其潜在生物学机制;
　　本部分研究中，我们初步探讨了TAM受体在巨噬细胞极化过程中的生物学机制;使用siRNA-Mer下调M0型巨噬细胞Mer表达后共培养凋亡胆管上皮细胞与M0型巨噬细胞，通过流式细胞术检测M2型巨噬细胞比例:在未加入siRNA-Mer组中，CD163+/CX3CR1+细胞比例显著高于加入siRNA-Mer，从而可知Mer表达水平可以有效促进M2型巨噬细胞方向极化;除了流式细胞术检测M2型巨噬细胞表型，为了进一步说明Mer受体对M2巨噬细胞极化的影响，同时检测了M2型巨噬细胞特异性基因包括CD206、CCL18、RANTES、MDC的表达以及特异性细胞因子TGF-β、VEGF、IL-10、TNF-α、IL-12的表达水平;结果显示CCL18及RANTES的表达水平在siRNA-Mer干扰后显著降低，而M2型巨噬细胞因子TGF-β、IL-10的表达水平显著的同样显著降低;随后进一步分析siRNA-Mer对M2型巨噬细胞极化调控过程中的相关信号通路的影响，发现在转染不同浓度的siRNA-Mer后巨噬细胞中总Akt蛋白水平无明显改变，而磷酸化Akt蛋白水平显著降低，且呈现剂量依赖性;随后使用Akt激动剂SC79模拟p-Akt功能后检测细胞培养液上清中M2型巨噬细胞比例，结果显示Akt激动剂SC79可以有效的中和siRNA-Mer对M2型巨噬细胞极化的抑制作用;结合上述M2型巨噬细胞表型、M2型特异性基因与细胞因子的水平变化，我们认为Mer主要通过影响下游信号通路Akt的磷酸化水平(p-Akt)，进而调控M2型巨噬细胞极化;此外，siRNA-Mer可以降低细胞培养上清中IL-10、IL-13的表达水平，而同时加入SC79后细胞上清上IL-10、IL-13水平显著升高;综合以上研究结果，本部分研究认为Mer受体能够促进M2型巨噬细胞极化，而其潜在的生物学机制是Mer受体通过调控p-Akt信号通路进而影响M2型巨噬细胞诱导因子IL-10、IL-13的表达与分泌，参与M2型巨噬细胞极化。

目录

声明

摘要

中英文对照缩略语对照表

第一部分：TAM受体家族在自身免疫性疾病中的表达水平及其临床意义

一、材料与方法

二、研究结果

三、讨论

第二部分：原发性胆汁性肝硬化患者血清游离TAM受体家族分子水平及其临床意义

一、材料与方法

二、研究结果

三、讨论

第三部分：原发性胆汁性肝硬化患者外周血单核巨噬细胞中TAM膜受体表达水平、巨噬细胞极化情况及二者之间的相关性

一、材料与方法

二、研究结果

三、讨论

第四部分：初步探讨Mer对巨噬细胞极化的调节作用及其潜在生物学机制

一、材料与方法

二、实验结果

三、讨论

参考文献

综述

在读期间发表论文和参加科研工作情况说明

致谢