基于发形霞水母触手转录组分析的抗菌活性蛋白的筛选、克隆表达与活性研究

摘要

海洋微生物种类丰富，不仅有陆地常见的病原微生物，也有海洋特有的致病微生物。长时间与海水接触的皮肤和软组织创面极易出现弧菌感染，可在较短时间内引发严重的损伤，甚至危及生命。此外，随着滨海旅游业和海洋渔业的迅猛发展，海洋微生物引起感染的病例也越来越多见。常用抗生素对海洋致病微生物的感染治疗效果欠佳，亟需开发新型特异性抗海洋致病微生物的活性物质。
　　水母是一种常见的海洋浮游动物，体腔开放浸泡于海水中，其口腕及伞部外沿生有细长的触手，与海水接触面积大，体表及机体组织长期接触多种致病性细菌和真菌。由于水母缺乏获得性免疫系统，因此其先天免疫防御系统功能强大，这对于生存在复杂海水表层环境中的水母抵御外界细菌、病毒入侵具有重要意义。尽管如此，目前对水母体内先天免疫防御系统的组成、重要抗菌蛋白的序列信息、表达情况、活性水平等尚不清楚。
　　第一部分:
　　基于Illumina HiSeqTM2000平台成功构建了发形霞水母(Cyanea capillata)触手组织转录组，共获得了50，536条有效Unigenes序列。其中21，357条Unigenes在公共数据库中得到同源注释。通过对其进行分析筛选和功能分类，我们发现该转录组中存在大量免疫防御功能相关的编码序列，如蛋白酶抑制剂、杀菌/通透性增加蛋白(BPI)、凝集素和热休克蛋白等。此外，还筛选出多种毒性作用相关分子、疾病相关分子、抗氧化活性因子和胶原蛋白等具有重要功能的编码序列。为今后深入研究水母免疫防御的物质基础和其他重要活性分子奠定了坚实的基础。
　　第二部分:
　　结合文献报道，从C.capillata转录组中筛选出两个重要抗菌活性蛋白编码序列，分别命名为CcKPI1(Cyanea capillata Kazal-type proteinase inhibitor1)和CcBPI1(Cyanea capillata bactericidal/permeability-increasing protein1)，利用生物信息学分析软件对序列进行深入分析，发现CcKPI1含176个氨基酸残基，预测分子质量为19.02kDa，为分泌蛋白。CcKPI1含有三个高度保守的Kazal结构域。多重比对和进化树分析显示，CcKPI1和其他物种来源的Kazal型丝氨酸蛋白酶(KPI)相似度较高，表明该分子为水母来源的KPI家族新成员。CcBPI1含478个氨基酸残基，预测分子质量53.66kDa，为分泌蛋白。CcBPI1含有两个典型的BPI结构域。多重比对和进化树分析显示，CeBPI1和其他物种来源的BPI相似度较高，表明该分子为水母来源的BPI家族新成员。
　　成功构建了CcKPI1原核表达重组质粒CcKPI1-pET24a、 CcKPI1-pET28a、CcKPI1-pET32a和CcKPI1-pGEX-6P-1，对比分析后确定最适合表达的重组质粒为CcKPI1-pGEX-6P-1，其可在E.coli Rosetta(DE3) pLysS中高效、稳定且以可溶性形式表达，获得与预期分子量一致的重组蛋白。通过AKTA蛋白分离纯化系统得到高纯度和高浓度的rCcKPI1融合蛋白，并经SDS-PAGE电泳及GST抗体检测鉴定为目的蛋白。同时成功构建了CcBPI1原核表达重组质粒CcBPI1-pET24a、CcBPI1-pET28a、CcBPI1-pET32a和CcBPI1-pGEX-6P-1，对比分析后确定可以正确表达的重组质粒为CcBPI1-pGEX-6P-1，其可在E.coli Rosetta(DE3)pLysS中少量表达，获得与预期分子量一致的重组蛋白。但由于rCcBPI1在原核系统中的表达量过低，不易纯化，因此进一步选择毕赤酵母表达体系对其进行诱导表达。将重组表达质粒CcBPI1-pPIC9成功转入毕赤酵母GS115中，但尚未获得正确表达的重组融合蛋白，表达条件还需进一步摸索和优化。
　　第三部分:
　　实时定量PCR分析表明，CcKPI1与CcBPI1在检测的所有组织中均有表达。CcKPI1在性腺中表达量最高，其他依次是触手、伞盖和口腕。CcBPI1在口腕中表达量最高，其他依次是伞盖、性腺和触手。
　　rCcKPI1重组蛋白的活性检测:(1)通过比色法测定rCcKPI1蛋白抑制丝氨酸蛋白酶的能力和抑制动力学参数，发现rCcKPI1蛋白能明显抑制枯草杆菌蛋白酶A、蛋白酶K和弹性蛋白酶的活性，抑制常数分别为0.014、0.015和1.538μM，均为竞争性抑制。(2)通过免疫印迹实验和免疫共聚焦实验检测rCcKPI1蛋白和微生物结合的活性。结果表明，rCcKPI1蛋白能有效地结合多种微生物，包括金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆菌、白色假丝酵母菌、热带假丝酵母菌、近平滑假丝酵母菌、光滑假丝酵母菌、单胞霉菌和多种常见海洋致病性弧菌（创伤弧菌、霍乱弧菌、溶藻弧菌、需钠弧菌、副溶血弧菌和拟态弧菌），但未检测到其与鳗弧菌和霍利斯弧菌的结合活性。(3)通过微量液体稀释法检测rCcKPI1蛋白抑制微生物生长的能力，发现rCcKPI1蛋白可以显著抑制大部分与其有结合活性的微生物（细菌、真菌、常见的海洋致病弧菌等）的生长。
　　本研究成功构建了发形霞水母触手组织转录组，首次获取了发形霞水母的触手转录谱。通过对其进行分析筛选和功能分类，发现该转录组中存在大量重要生物学活性相关的编码序列，包括免疫防御相关因子、毒性效应分子、与疾病相关的分子、抗氧化相关蛋白和胶原蛋白等，为深入研究水母免疫防御的物质基础和其他重要活性分子奠定了坚实的基础。对筛选出的重要抗菌活性蛋白编码序列（CcKPI1和CcBPI1）进行了完整的生物信息学分析，通过重组克隆和诱导表达，纯化得到了两个序列明确、功能单一的重要抗菌功能蛋白。活性功能检测发现，CcKPI1具有明显的抑制丝氨酸蛋白酶的活性，抗菌功能研究发现，该分子能结合多种致病微生物并显著抑制微生物的生长。以上结果表明，CcKPI1具有明显的抗菌活性，能有效对抗常见致病细菌、真菌和常见海洋致病弧菌，推测CcKPI1可能在C.capillata免疫防御中发挥重要作用。本研究也为开发具有抗菌功能的新型海洋药物提供了科学依据和新的资源途径。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

第一部分：发形霞水母触手转录组的构建与分析

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

四、小结

第二部分：发形霞水母重要抗菌活性蛋白的分析筛选、克隆表达与纯化

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

四、小结

第三部分：发形霞水母重要抗菌活性蛋白的组织分布及其活性研究

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

四、小结

全文总结

参考文献

文献综述(已发表)

在读期间参加科研工作情况

致谢