瑞香狼毒毒性物质基础研究

摘要

瑞香狼毒Stellera chamaejasme L.始载于《神农本草经》，一般取其根部入药，味辛、性平、有毒，入肺、肝，有逐水祛痰，散结杀虫的功效。目前关于瑞香狼毒中化学成分的诸多研究表明，瑞香狼毒含有多种黄酮类、木脂素类、二萜类、香豆素类等化学成分，而且随着炮制方法的改变，瑞香狼毒中化学成分的含量及有效成分均发生着相应的变化，导致其毒性程度也作出相应改变。现代药理研究学表明，瑞香狼毒的水提液、醇提液或者不同种的炮制品均表现出一定的抗癌活性。然而在关于瑞香狼毒的毒性报道中，一部分是从植物毒性的角度来阐述瑞香狼毒的毒性作用，大多数是探索其不同极性部位的提取物对于动物或体外细胞的毒性研究，究竟何种物质产生动物毒性鲜有研究，因此本课题将关于瑞香狼毒产生动物毒性的物质基础进行深入系统的研究。
　　1、利用HPLC-TOF/MS联用技术，对瑞香狼毒各极性部位中的化学成分进行鉴别分析。实验采用Agilent Poroshell120EC-C18色谱柱(2.1×100mm，2.7μm)，0.1％甲酸水溶液-乙腈流动相系统对样品进行梯度洗脱，采集ESI负离子模式下的质谱信息，对照建立的化合物数据库整合分析，最终鉴别得到瑞香狼毒总提物中的49种化学成分，石油醚提取物中的34种化学成分，乙酸乙酯提取物中的23种化学成分，正丁醇提取物中的23种化学成分，为下一步瑞香狼毒的毒性物质基础研究提供了一种快速高效的成分检测方法。
　　2、对ICR小鼠进行急性毒性灌胃实验，用以筛选瑞香狼毒毒性部位。分别提取瑞香狼毒的不同极性部位，制备呈灌胃混悬液。在灌胃相同剂量（10g/kg）的不同极性部位提取物混悬药液的情况下，乙酸乙酯组的小鼠存活率最低，证明了在相同剂量下的不同极性部位灌胃溶液中，乙酸乙酯毒性最强，初步可以确定瑞香狼毒的毒性部位在于乙酸乙酯部位。之后各组分别灌胃不同浓度的乙酸乙酯部位混悬液，连续观察7d，详细记录小鼠死亡情况。根据实验结果，利用PASW Statistics18.0软件进行Probit分析可得，瑞香狼毒乙酸乙酯提取物急性经口毒性的LD50为4.656g/kg。
　　3、采用柱层析技术与高效液相色谱制备等技术对瑞香狼毒乙酸乙酯部位进行提取分离，得到单体化合物。通过使用高效液相-飞行时间质谱联用技术获得单体化合物的详细质谱信息，同时结合高分辨核磁共振波谱结果，对提取分离到的单体化合物进行结构鉴定。共确定了12种单体化合物的分子结构，分别为表枇杷素(Epiafzelechin)、莨菪亭(Scopoletin)、异落叶松脂素(Isolariciresinol)、鹅掌揪树脂酚B(Lirioresinol B)、瑞香酚(Stelleranol)、西瑞香素(Daphnoretin)、狼毒色原酮(Chamaechromone)、新狼毒素A(Neochamaejasmin A)、狼毒素(Chamaejasmine)、异狼毒素(Isochamaej asmin)、7-甲氧基新狼毒素A(7-methoxyneochamaejasmin A)及罗汉松脂素(Matairesinol)。
　　4、采用血清药理学的方法，对小鼠灌胃毒性部位提取物中毒剂量后的血清移行成分及毒性靶器官中的成分进行检测。基于高效液相色谱串联飞行时间质谱仪技术，建立一种对小鼠灌胃毒性部位中毒剂量后的血清移行成分及组织内药物原型的检测方法，分别得到空白血浆与给药后血浆的对比总离子流图、空白组织与给药后组织的对比总离子流图，并根据扣除空白项之后找到各图中的差异峰。为进一步确定差异峰的化学成分，我们将之前提取得到的瑞香狼毒乙酸乙酯部位的单体化合物在相同色谱质谱条件下进样分析，通过比较各峰的保留时间及其质谱信息，最终对血浆及组织中分布的毒性成分进行定性，分别为表枇杷素、异狼毒素、狼毒素、狼毒色原酮、新狼毒素A以及瑞香酚六种化合物。通过对比等量组织中的原型成分含量，可以确定六种化合物在肝脏组织中分布最多最广。
　　5、采用体外细胞模型实验对瑞香狼毒中的六种化合物进行了正常肝细胞系L02的抑制率研究。通过使用MTT比色法得到化合物在不同浓度下对于正常肝细胞系L02的抑制率，对比相同给药浓度下各化合物的细胞抑制率，表枇杷素对正常肝细胞系基本无抑制作用，剩余五种化合物对正常肝细胞系有不同程度的增值抑制作用。
　　6、基于超高效液相色谱串联三重四级杆质谱技术，建立一种测定大鼠灌胃瑞香狼毒乙酸乙酯部位后体内的异狼毒素、狼毒素、狼毒色原酮、新狼毒素A以及瑞香酚五种黄酮类成分的含量测定方法，并采集其药动学参数，经过一系列的方法学考察，证实该方法灵敏度高且专属性强，可以为日后对于这五种黄酮类化合物的药效学、毒理学研究提供一定的参考。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

第一章 HPLC-TOF／MS鉴别瑞香狼毒化学成分

一、引言

二、仪器与试药

(一)仪器

(二)试药

三、方法与结果

(一)分析条件

(二)供试品溶液的制备

(三)瑞香狼毒化学成分数据库的建立

(四)HPLC-TOF／MS对瑞香狼毒总提物的鉴别

(五)HPLC-TOF／MS对瑞香狼毒石油醚部位的鉴别

(六)HPLC-TOF／MS对瑞香狼毒乙酸乙酯部位的鉴别

(七)HPLC-TOF／MS对瑞香狼毒正丁醇部位的鉴别

四、讨论

(一)色谱条件的优化

(二)质谱条件的优化

五、小结

第二章 瑞香狼毒毒性成分的筛选及毒性评价

第一节 瑞香狼毒毒性部位的确定

一、引言

二、仪器与试药

三、方法与结果

四、讨论

五、小结

第二节 瑞香狼毒毒性部位单体成分的分离与鉴定

一、引言

二、仪器与试药

三、方法与结果

四、讨论

五、小结

第三节 瑞香狼毒毒性成分的体内分布

一、引言

二、仪器与试药

三、方法与结果

四、讨论

五、小结

第四节 瑞香狼毒毒性成分的体外毒性评价

一、引言

二、仪器与材料

三、方法与结果

四、讨论

五、小结

第三章 UPLC-MS／MS对瑞香狼毒中5种黄酮类成分的毒代动力学研究

一、引言

二、仪器与试药

(一)仪器

(二)试药

(三)动物

三、方法与结果

(一)分析条件

(二)对照品溶液的制备

(三)灌胃药材溶液的制备

(四)血浆的收集

(五)血浆的前处理

(六)方法学验证

(七)毒代动力学研究

四、讨论

(一)色谱条件的优化

(二)质谱条件的优化

五、小结

参考文献

综述 中药毒性的研究进展

在读期间发表论文和参加科研工作情况说明

致谢