成人手足口病相关肠道病毒非中和抗体反应的初步研究

摘要

肠道病毒(enterovirus，EV)是自然界中普遍存在的一类病毒，至今已发现200多个血清型和基因型，可引发多种疾病，包括常见的由EV71和CA16感染引起的手足口病(hand，foot，and mouth disease，HFMD)。目前中和抗体检测是对肠道病毒血清学检测的有效途径，对于以交叉表位为核心的非中和抗体反应的研究尤其是肠道病毒的ELISA检测方面尚未形成有价值的研究成果。
　　本研究首次应用非中和抗体检测的方法，探究到正常人群血清中肠道病毒A种(CA5、CA10、CA6、CA16、EV71)，对照组肠道病毒B种(CB3)和C种(PV1)几种病毒VP1的非中和抗体水平及其动态变化，提高了对肠道病毒感染的普遍性的认识，对建立基于ELISA和竞争ELISA的肠道病毒流行病学监测方法有重要意义。
　　（一）肠道病毒VP1序列的全基因合成及原核表达
　　全基因合成了PVI和HAV衣壳蛋白VP1的DNA序列，构建pET-32a-PV1 VP1和pET-32a-HAV VP1原核表达载体。另选取本实验室已制备好的pET-32a-EV71 VP1，pET-32a-CA16 VP1,pET-32a-CA5 VP1,pET-32a-CA6 VP1,pET-32a-CB3 VP1原核表达载体，原核表达并用镍柱亲和层析的方法纯化上述七种重组蛋白;经SDS-PAGE和Western blot鉴定，获得了纯度较高的EV71，CA16，CA5，CA6，CB3，PV1和HAV VP1的重组蛋白。
　　（二）上海献血员肠道病毒VP1非中和抗体反应的检测和分析
　　以本实验室自主研发的新型免疫球蛋白结合分子(Novel Evolved Immunoglobulin(Ig)-Binding Molecule，NEIBM)LD5作为二抗，应用NEIBM-ELISA方法，分别检测了肠道病毒A种的EV71，CA16，CA5，CA6，肠道病毒B种的CB3，肠道病毒C种的PV1及嗜肝病毒属的HAV等七种肠道病毒VP1在2013年8月和2014年5月收集的上海市正常献血员血清中的非中和抗体反应水平，并对48份高反应血清进行了竞争ELISA检测。通过对抗体反应水平、抗体反应相关系数、竞争抑制水平和竞争抑制的相关系数等指标的综合分析发现，上海正常人群血清中普遍存在肠道病毒的非中和反应抗体;不同病毒的抗体反应强度不同，抗CB3 VP1非中和抗体反应最强，抗PV1 VP1次之，抗肠道病毒A种VP1反应较弱，抗HAV VP1抗体反应最弱;不同病毒VP1非中和抗体反应的相关系数与氨基酸序列的同源性水平成正比;EV71VP1与肠道病毒A种的其他成员的非中和抗体反应特点不同;不同时间，肠道病毒的非中和抗体反应出现明显差异。
　　（三）上海献血员肠道病毒VP1非中和抗体反应的动态监测
　　为深入探究肠道病毒的非中和抗体反应能否用于肠道病毒流行情况的检测，本实验继续应用NEIBM-ELISA和竞争ELISA两种方法，检测肠道病毒A种的CA10，CA6，CA16，EV71，肠道病毒B种的CB3，肠道病毒C种的PV1六种肠道病毒VP1在2014年4月、2014年6月、2014年8月、2014年10月、2014年12月和2015年3月收集的上海市正常献血员血清中的非中和抗体反应的动态变化。对抗体反应水平、抗体反应相关系数、竞争抑制水平和竞争抑制的相关系数等指标的分析发现:不同时间，各病毒VP1的反应性水平无明显变化;不同时间，抗体反应的相关系数相对平稳;不同时间，各病毒VP1竞争抑制率的差异无统计学意义。与上述指标不同的是，竞争抑制率相关系数有很明显的变化:CA16 VP1与EV71 VP1竞争抑制抗-CA16 VP1的相关系数随时间变化明显，2014年4月和6月，二者相关系数小于0.1，8月-12月二者相关系数均大于0.4，提示2014年4月，正常人群中可能有CA16的流行;2014年8月，CB3 VP1与除CB3以外的其他肠道病毒VP1竞争抑制抗-CB3 VP1的相关系数出现了一致的明显下降，提示2014年8月，正常人群中可能有CB3的流行;2014年6月，CA10 VP1与除CA10以外的其他肠道病毒VP1竞争抑制抗-CA10VP1的相关系数出现了一致的明显下降，提示2014年6月，正常人群中可能有CA10的流行;2014年10月，PV1 VP1与除PV1以外的其他肠道病毒VP1竞争抑制抗-PV1VP1的相关系数出现了一致的明显下降，提示2014年10月，正常人群中可能有PV1的流行。
　　为验证上述对肠道病毒在正常人群中流行状况的推测，我们又进行了正常献血员血清抗肠道病毒VP1-IgG、IgM的非中和抗体检测。分析抗体反应水平和相关系数可知，2014年4月，抗-CA16 VP1 IgG和IgM抗体反应水平与其他月份有统计学差异，2014年4月至8月，抗-CA16 VP1 IgG和IgM抗体反应相关系数大于0.4，高于其他月份，支持2014年6月正常人群中有CA16的流行;2014年8月-12月，抗-CB3 IgG和IgM反应性相关系数大于0.3，高于其他月份，支持2014年8月正常人群中有CB3的流行;2014年6月抗-CA10 VP1 IgG和IgM的反应相关系数达到最高值，推测2014年6月正常人群中有与CA10相近病毒的流行;2014年10月抗-PV1 VP1 IgG和IgM的反应相关系数达到最高值，推测2014年10月正常人群中有与PV1相近病毒的流行。
　　上述研究说明正常人群中肠道病毒非中和抗体检测和分析可反映肠道病毒在正常人群中的流行状况，进一步改进后有望成为评价、监测肠道病毒流行状况的新方法。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

第一部分 多种肠道病毒VP1全基因合成及原核表达纯化

一、材料与方法

二、实验结果

三、讨论

第二部分 上海献血员肠道病毒VP1非中和抗体反应的检测和分析

一、材料与方法

二、实验结果

二、讨论

第三部分 上海献血员肠道病毒VP1非中和抗体反应的动态监测

一、材料与方法

二、实验结果

三、讨论

参考文献

附录

综述

发表论文和参加科研工作情况说明

致谢