iRhom2通过Notch信号通路影响机械通气性肺损伤的机制

摘要

机械通气是一种用于维持呼吸功能以及在各种临床和手术情境下使病人呼吸负担降到最低的支持性疗法。然而，它可能引起肺损伤，导致机械通气性肺损伤（ventilator-induced lung injury，VILI）。肺保护性通气策略是急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)患者的标准治疗手段，这使VILI的临床意义越来越受到重视。对于需行机械通气支持疗法的ARDS以及其他重症病人，预防和缓解VILI仍然是麻醉围手术期医学和危重病医学界研究的热点和难点。
　　VILI的发生机制包含了肺气压伤，肺容积伤，肺不张伤以及生物伤。高通气量或高气压的机械通气可通过许多不同的临床相关机制引起促炎介质的释放。肺气压伤，肺容积伤，肺不张伤以及生物伤并不是相互排斥的，因为通过引起应力破坏，前三者均可导致生物伤，因此生物伤成为现在研究的焦点。
　　肺泡巨噬细胞(alveolar macrophage，AM)在免疫自身稳定及宿主防御的维护中发挥着至关重要的作用，并且它们是肺部暴露于伤害性刺激后促炎细胞因子的主要生产者。巨噬细胞能被机械通气迅速激活，这表明它们可能在VILI的发病机制中发挥重要作用。但机械通气激活和调控肺泡巨噬细胞活化的机制尚未完全阐明。
　　Notch信号活化的“三步蛋白水解模型”:首先，Notch受体在高尔基体被Furin切割组装成成熟的异二聚体受体，随后异二聚体受体被转运到细胞表面与配体结合，被ADAM10/Kuz或ADAM17/TACE切割，最后被膜内的γ-促分泌酶切割，引起NICD的释放。NICD转运到细胞核，与CSL结合后激活下游Hes等靶基因，最终影响细胞的增殖、分化和凋亡。Notch信号可以增加核因子-kappa B(NF-κB)的活化，后者被证实可以促进VILI的发生，因此，Notch信号通路在VILI中可能也发挥调节作用。此外，有实验证明TACE在Notch通路的激活中有显著作用。
　　非活动的菱形蛋白2(inactive rhomboid-like protein2，iRhom2)属于Rhomboid蛋白家族，目前已经发现十余种Rhomboid蛋白家族成员，它们参与了各种细胞内外的信号转导。在巨噬细胞中，iRhom2与TACE结合并促进其从内质网中排出，而缺乏iRhom2导致TACE从内质网排出失败，阻止了TACE向细胞表面的转运，进一步影响了TACE的功能。
　　由此推测，iRhom2可能通过iRhom2/TACE/Notch通路影响机械通气性肺损伤。通过研究Notch信号通路在机械通气性肺损伤中的作用，进而调控肺泡巨噬细胞中的iRhom2来观察Notch信号通路活化的程度，有利于阐明iRhom2影响机械通气性肺损伤的作用机制，为临床干预机械通气性肺损伤提供新的线索和靶点，为防治机械通气性肺损伤提供理论依据和临床策略。
　　第一部分 机械通气对肺泡巨噬细胞Notch信号通路的影响
　　目的:通过在健康的小鼠身上构建机械通气性肺损伤模型，就机械通气对肺泡巨噬细胞Notch信号通路的影响进行深入研究。
　　方法:随机选取3只C57BL/6小鼠为一组，共分3组(n=3)，一组作为对照(Con)，另一组低潮气量通气（LVT，VT=7ml/kg），第三组高潮气量通气(HVT，VT=20ml/kg)。在持续通气4小时后，将小鼠的肺组织取出，通过肺组织病理学切片检查及肺损伤评分，肺组织湿干重量比，肺EBA渗透指数以及肺泡灌洗液中蛋白含量等对肺损伤的情况进行评价和分析;对肺泡灌洗液中的细胞总数及各种炎症因子进行测量，从而对肺部炎症的反应程度进行评价。在持续四小时的机械通气之后，对肺泡巨噬细胞进行分离提取，并用Western Blot方法对NICD蛋白含量进行检测，用PCR方法对Hes-5 mRNA水平进行检测，从而对与Notch通路相关的蛋白表达水平进行评价。
　　结果:与对照组相比，高潮气量机械通气不仅能够引起肺组织的损伤，还可以增加肺组织的湿干重量比、肺EBA渗透指数以及肺泡灌洗液中蛋白的含量，同时升高了肺泡灌洗液中细胞总数及TNF-α、IL-6、MIP-2等炎症因子的表达水平。在持续进行四小时的高潮气量机械通气之后，对肺泡巨噬细胞进行收集，Western Blot结果显示细胞中NICD蛋白水平显著升高，RT-PCR结果显示Hes-5基因的表达水平也明显升高。
　　结论:高潮气量机械通气不仅可以促使小鼠肺组织的损伤，还对Notch信号通路具有激活作用。
　　第二部分 机械通气性肺损伤中Notch信号通路的作用
　　目的:研究机械通气性肺损伤中Notch信号通路的作用。
　　方法:随机选取3只C57BL/6小鼠为一组，共分3组(n=3)，一组作为对照(Con)，另一组高潮气量通气(HVT)，第三组则为DAPT组。在机械通气前给予DAPT组小鼠腹腔注射Notch信号通路抑制剂DAPT100mg/kg，其余各组均给予等剂量的DAPT溶剂DMSO。停止机械通气后，对病理学切片进行检查，完成肺损伤评分，同时检测肺湿干重量比、肺EBA渗透指数以及肺泡灌洗液中蛋白含量，通过这些检测对肺损伤的程度进行评定，肺泡灌洗液中细胞计数和相应炎症因子的测定评估肺部的炎症反应，对肺泡巨噬细胞进行分离提取，通过Western Blot的方法对NICD蛋白含量的变化进行检测。
　　结果:与单纯高潮气量通气组相比，DAPT组的肺组织损伤程度明显减轻。另外，DAPT组的肺组织湿干重量比、肺EBA渗透指数以及肺泡灌洗液中蛋白含量都明显低于单纯高潮气量通气组;肺泡灌洗液中包括TNF-α、IL-6、MIP-2等在内的炎症因子水平也明显低于单纯高潮气量通气组。Western Blot结果显示DAPT组细胞中NICD蛋白水平较单纯高潮气量通气组也明显下降。
　　结论:Notch信号通路参与了机械通气性肺损伤的形成，抑制该通路后能显著减轻肺损伤程度。
　　第三部分 机械通气性肺损伤中iRhom2对肺泡巨噬细胞Notch信号通路的影响
　　目的:研究iRhom2对巨噬细胞中Notch信号通路的影响。
　　方法:将RAW264.7细胞分为2组(n=3)，对照组（R-Con组）以及经慢病毒转染iRhom2蛋白下调的iRhom2蛋白下调组(R-iRhor2-/-)，收取细胞后，通过Westem Blot方法检测细胞中NICD的表达。
　　结果:Western Blot结果显示iRhom2蛋白下调组(R-iRhom2-/-)细胞中NICD蛋白水平较对照组（R-Con组）明显下降。
　　结论:iRhom2下调可以降低巨噬细胞中Notch信号通路的活化标志蛋白NICD的表达。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

第一部分 机械通气对肺泡巨噬细胞Notch信号通路的影响

一、实验材料

二、实验方法

三、实验设计及分组

四、实验结果

第二部分 机械通气性肺损伤中Notch信号通路的作用

一、实验材料

二、实验方法

三、实验设计及分组

四、实验结果

第三部分 机械通气性肺损伤中iRhom2对肺泡巨噬细胞Notch信号通路的影响

一、实验材料

二、实验方法

三、实验设计及分组

四、实验结果

讨论

全文总结

参考文献

综述 机械通气所致肺损伤的机制研究进展

硕士在读期间发表论文

致谢