HIF-1α在早期糖尿病肾脏纤维化易感性中的作用机制研究

摘要

研究背景及目的：
　　糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)作为糖尿病的严重并发症，已经成为导致终末期肾病(end-stage renal disease，ESRD)的主要病因之一。据报道，在发达国家，糖尿病肾病是导致慢性肾脏疾病(chronic kidney disease，CKD)的首要原因。而在我国，糖尿病肾病是仅次于慢性肾小球肾炎导致CKD的第二大因素。这主要由两方面造成:一是糖尿病发病率日趋升高以及发病年龄年轻化;二是人口老龄化。肾脏纤维化是DN的主要病理表现形式，可能的病理机制包括:(1)高血糖导致血流动力学紊乱和代谢紊乱;(2)转化生长因子、血管内皮生长因子等细胞因子的激活;(3)血管活性物质代谢异常，比如一氧化氮合酶活性降低导致一氧化氮合成减少;(4)肾脏高滤过导致的氧耗增加以及细胞外基质增多导致的氧气弥散障碍。虽然目前临床上有大量控制血压、血糖、血脂及肾素-血管紧张素系统的相关药物，但是仍旧不能延缓疾病进展。其高致残率和致死率，给患者家庭和社会带来了沉重的精神和经济负担。
　　有趣的是，有部分患者尽管血糖控制较好，仍无法避免进展为ESRD。而有些患者即使血糖控制不佳，肾功能却能维持在稳定的水平。一方面与个体的异质性有关;另一方面可能与一些促纤维化始动因素的存在有关。
　　本研究利用链脲佐菌素(streptozocin，STZ)诱导的1型糖尿病和Akita自发性1型糖尿病鼠（6-8周龄）合并单侧输尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction,UUO)。研究结果证实，同样是UUO手术，糖尿病组小鼠肾脏损伤程度明显高于非糖尿病组，包括纤维化、细胞凋亡和炎细胞浸润。体外实验同样证实，高糖刺激下的小鼠肾小管上皮细胞在缺氧条件下fibronectin蛋白表达量高于其他各组。从这些现象可以看出，无论是体内还是体外条件下，高糖组更易于发生纤维化。那么究竟是何种因素促使这种现象发生？其潜在的作用机制是什么？
　　为了阐述这个问题，我们将目光聚焦于明星分子——缺氧诱导因子(hypoxiainducible factors，HIFs)。肾脏血流大约占心输出总量的20％，但是由于肾脏特殊的生理解剖结构以及丰富的代谢活动，导致肾脏极易出现缺氧。缺氧诱导因子是机体组织为适应缺氧而产生的一类因子，主要包括HIF1、HIF2和HIF3，其中研究较多的为前两种。HIF1和HIF2（统称为HIF）属于PAS(per/aryl-hydrocarbon-receptor nuclear translocator/Sim，PAS)家族，是含有碱性螺旋-环－螺旋结构(basic helix-loop-helix，bHLH)的一类转录因子。HIF是一种异原二聚体蛋白，包括α亚基β亚基。由于β亚基结构与芳香羟受体核转位蛋白（hydrocarbon-receptor nuclear translocator，ARNT）结构相同，故又称为ARNT。正常情况下，HIFβ亚基在细胞浆中稳定表达，HIFα在翻译后即被泛素-蛋白酶体复合物降解。当机体处于缺氧环境时，HIFα无法经泛素化途径降解，转移到细胞核中，与HIFβ以及CBP/p300结合形成稳定复合物，调控下游相关靶基因表达，比如调节血管生成、红细胞生成、糖酵解、细胞增殖、细胞凋亡，调整氧气的分布和提高机体对缺氧的耐受力。
　　肾脏包含有多种细胞类型，并且在表达HIF方面存在差异。研究证实HIF1主要在肾小管和肾小球上皮细胞内表达，而HIF2主要表达于血管内皮细胞和间质纤维化细胞中。有许多研究表明HIF在调控多种肾脏疾病具有重要作用，比如缺血/再灌注相关急性肾损伤，5/6肾切除导致的慢性肾脏病等。对于HIF在调控糖尿病肾病纤维化方面所起的作用，目前仍存在诸多争议。Nayak等学者证实糖尿病动物模型引起的肾小球及间质纤维化中有HIF表达，Rosenberger等学者同样发现HIF1α不仅表达于糖尿病动物模型，在糖尿病肾病患者的病理标本中同样有HIF1α的表达。本研究证实HIF1α在早期糖尿病纤维化中高表达，在一定程度上反映了HIF1α可能在调控早期糖尿病纤维化方面起一定作用。
　　研究方法：
　　首先，利用STZ诱导的1型糖尿病小鼠模型和C57BL/6J-Ins2Akita/+小鼠模型（由于6-8周龄年龄小鼠血糖升高仅有2-3周，可视为早期糖尿病模型），进行UUO手术，通过马松三色染色及四型骨胶原荧光染色观察肾脏组织的骨胶原沉积，利用Western blot观察纤维化指标和HIF1α表达情况;利用巨噬细胞markerF4/80染色来评估肾脏组织内的炎症浸润情况;肾脏组织细胞的凋亡主要依赖原位末端转移酶标记法（TdT-mediated dUTP mick-end labeling，TUNEL）。同时，运用体外细胞模型--小鼠肾小管上皮细胞(the mouse PT cell，BUMPT-306 cell)，进一步证实HIF1α在缺氧条件下高糖组的表达情况。明确HIF1α是否在糖尿病早期参与肾脏纤维化的形成。
　　其次，利用HIF1α的特异性抑制剂3-(5'-羟甲基-2'-呋喃基)-1-苯甲基吲唑{3-(5-hydroxymethl-2-furyl)-1-benzylindazole，YC-1}干预细胞，通过Western blot观察其对HIF1α和纤维化指标表达的影响。另外利用HIF1α shRNA转染大鼠肾小管上皮细胞(renal proximal tubular cell，RPTC)和人胚肾细胞(human embryonickidney，HEK)293，沉默HIF1α在上述细胞系内的表达，进一步观察HIF1α和纤维化指标的表达。
　　最后，利用HIF抑制剂YC-1干预行UUO后的Akita糖尿病小鼠，观察纤维化相关指标及HIF1α的表达。为了深入研究HIF1α的作用，我们利用近端小管HIF1α特异性敲除(PT-HIF1α KO)小鼠和对照组(PT-HIF1αWT)小鼠，连续5天低剂量注射STZ诱导1型糖尿病模型，观察发现PT-HIF1α KO小鼠较 PT-HIF1αWT小鼠而言，纤维化程度及肾损伤程度均较轻，进一步证实HIF1α与早期糖尿病肾病纤维化敏感性的关系。
　　研究结果：
　　(1) Akita小鼠和STZ诱导的1型糖尿病小鼠分别行UUO手术后，肾脏组织内骨胶原沉积呈时间依赖性上升，纤维化指标fibronectin，α-SMA表达上升，同时伴随HIF1α表达升高，且糖尿病组明显高于同期对照组。此外，糖尿病组肾脏组织细胞凋亡程度明显高于同期对照组，炎症指标F4/80结果显示手术后炎症细胞浸润明显增加，且糖尿病组高于对照组。
　　(2) HIF1α的特异性抑制剂YC-1干预BUMPT细胞，HIF1α表达下调的RPTC和HEK293细胞系都显示一致结果，fibronectin的表达降低，且降低程度与HIF1α表达抑制程度一致。
　　(3) YC-1干预UUO后的Akita糖尿病小鼠模型及PT-HIF1α KO和PT-HIF1αWT糖尿病小鼠模型显示，抑制HIF1α不仅可以降低骨胶原沉积、细胞外基质纤维化等指标的表达，还可以减少肾脏组织细胞凋亡和间质炎症细胞浸润。
　　结论：
　　本课题通过体内和体外实验证实了早期高糖可提高肾脏对纤维化的敏感性，并且这种易感性受HIF1α的调节。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

一、流行病学

二、发病机制

三、肾脏纤维化

四、缺氧诱导因子

第一部分 纤维化相关指标在体内模型中的表达

一、实验材料与仪器

二、实验方法

三、实验结果

四、讨论

第二部分 HIF-1α在糖尿病条件下体内外模型中的表达

一、实验材料与仪器

二、实验方法

四、讨论

第三部分 HIF-1α表达下调对高糖条件下细胞纤维化表达的影响

一、实验材料与仪器

二、实验方法

三、实验结果

四、讨论

第四部分 抑制HIF-1α对糖尿病条件下肾脏的影响

一、实验材料与仪器

二、实验方法

三、实验结果

四、讨论

全文总结

参考文献

综述 HIF1α在调控早期糖尿病肾病纤维化方面的作用

在读期间发表论文及获得奖励

致谢