力学敏感性lnc RNA MALAT1和NEAT1调控颈椎后纵韧带骨化机制的研究

摘要

目的：颈椎后纵韧带骨化症(ossification of the posterior longitudinal ligament，OPLL)是常见的脊柱疾病，尤其是在亚洲人群中发生较为多见，对患者健康有严重危害。本人所在课题组之前的研究发现应力加载对OPLL的发生及发展起重要影响，并建立了体外机械牵张拉力诱导的颈椎后纵韧带成纤维细胞(FC)的成骨分化模型。虽然前期研究对力学因素导致的后纵韧带骨化有了一定的诠释，但是仍未能解释清楚其确切的机制，需要进一步探索。长链非编码RNA(long-noncoding RNA，lncRNA)是指长度大于200nt的、非编码的RNA，能够参与并调控基因的表达，目前尚未有报道lncRNA在后纵韧带骨化病发生过程中的作用以及机制。因此本项研究将探讨lncRNA在应力加载所导致的后纵韧带骨化进程中的作用及机制。
　　方法：提取颈椎后纵韧带组织总RNA，利用lncRNA芯片检测骨化组织以及非骨化组织中lncRNA的表达差异。利用实时荧光定量PCR进行验证。分离并培养颈椎后纵韧带成纤维细胞，加载机械牵张拉力后检测lncRNA的表达变化。利用starbase软件分析lncRNA相结合的miRNA，然后利用Targetscan软件分析miRNA的靶基因。通过siRNA调控韧带成纤维细胞中lncRNA的表达，并检测相关miRNA以及靶基因的表达，调控韧带成纤维细胞中miRNA的表达并构建miRNA荧光素酶报告载体验证miRNA的靶基因。
　　结果： lncRNA芯片检测结果表明颈椎PLL骨化及非骨化组织中lncRNA差异性表达。lncRNA MALAT1和NEAT1在颈椎PLL骨化组织中的表达显著性高于非骨化组织。机械应力可以显著提高lncRNA MALAT1和NEAT1在颈椎后纵韧带FC中的表达。利用starbase软件分析发现lncRNA MALAT1可以和miR-30a-5p结合。利用Targetscan软件分析miR-30a-5p存在靶基因RUNX2。机械牵张拉力促进韧带成纤维细胞中lncRNA MALAT1的表达，降低miR-30-5p的表达从而促进靶基因RUNX2的表达。
　　结论 lncRNA在颈椎后纵韧带骨化组织和非骨化组织中存在表达存在差异;机械应力刺激促进颈椎后纵韧带成纤维细胞中lncRNA MALAT1和lncRNA NEAT1的表达;lncRNA MALAT1通过调控miR-30a-5p的表达促进RUNX2的表达。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

第一部分：机械牵张拉力刺激促进韧带成纤维细胞中lncRNA MALAT1和NEAT1的表达

一、引言

二、材料和方法

(一)主要试剂的配置

(二)颈椎后纵韧带成纤维细胞RNA提取

(三)实时荧光定量PCR检测

(四)颈椎后纵韧带FC的培养

(五)颈椎后纵韧带成纤维细胞传代培养

(六)细胞冻存

(七)颈椎后纵韧带组织石蜡包埋

(八)颈椎后纵韧带组织HE染色

(九)颈椎后纵韧带组织免疫组织化学染色

(十)质粒转化

(十一)质粒提取

(十二)成骨诱导分化

(十三)碱性磷酸酶(ALP)染色

(十四)碱性磷酸酶(ALP)活性定量

(十五)茜素红染色

(十六)茜素红定量

(十七)成脂肪诱导分化

(十八)油红O(oil red)染色

(十九)成软骨诱导分化

(二十)Micromass组织学处理

(二十一)阿尔新蓝(Alcian blue)染色

(二十二)Western blot检测

三、统计学方法

四、结果及结论

(一)颈椎后纵韧带样本收集

(二)颈椎后纵韧带成纤维细胞的分离培养

(三)基因芯片检测颈椎后纵韧带骨化和非骨化患者韧带组织中lncRNA的表达差异

(四)lncRNA MALAT1和NEAT1在颈椎后纵韧带骨化组织和非骨化组织中的表达

(五)力学刺激对颈椎后纵韧带FC成骨分化的影响

(六)lncRNA MALAT1和NEAT1在力学诱导的颈椎后纵韧带成纤维细胞成骨分化过程中的表达

(七)颈椎后纵韧带成纤维细胞的干细胞特性

五、讨论

第二部分：lncRNA MALAT1和NEAT1调控颈椎后纵韧带成纤维细胞骨化的分子机制研究

一、引言

二、材料和方法

(一)主要试剂的配置

(二)颈椎后纵韧带成纤维细胞RNA提取

(三)实时荧光定量PCR检测

(四)颈椎后纵韧带FC的培养

(七)碱性磷酸酶(ALP)染色

(八)碱性磷酸酶(ALP)活性定量

(九)Western blot检测

三、统计学方法

四、结果及结论

(一)lncRNA MALAT1在力学诱导的颈椎后纵韧带成纤维细胞成骨分化中的作用

(二)lncRNA MALAT1调控miR-30a-5p的表达

(三)miR-30a-5p靶基因预测与验证

五、讨论

综述

参考文献

在读期间发表论文与参加科研工作情况说明

致谢