Bruton's酪氨酸激酶抑制剂联合硼替佐米对人多发性骨髓瘤细胞的作用及其机制

摘要

背景及目的:多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是一种恶性浆细胞增殖性疾病，是常见的血液系统恶性肿瘤之一。虽然近年来对其治疗取得了一定进展，如蛋白酶体抑制剂硼替佐米(bortezomib)的应用极大提高了治疗的总反应率，延长了患者生存期，但MM仍不可治愈，复发率高。除初治不敏感的患者外，有近一半的初治敏感患者复发后对硼替佐米治疗的反应性降低，因此寻找新的治疗药物、探索新的联合用药方案是进一步提高MM疗效和预后的关键。
　　Bruton't酪氨酸激酶(Bruton't tyrosine kinase，BTK)是一种胞浆酪氨酸蛋白激酶，主要表达于各分化阶段的B细胞，是B细胞抗原识别受体(B-cell antigenreceptor，BCR)信号通路的重要组分，对正常B细胞的分化、发育和功能有重要影响。近年的研究表明，BTK在多种B细胞性恶性肿瘤（如慢性淋巴细胞白血病、弥漫大B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤）中的表达及活性增高，增强了肿瘤细胞的存活和增殖。ibrutinib是针对BTK的选择性抑制剂，可与BTK活性位点的半胱氨酸残基(Cys-481)共价结合，并抑制其磷酸化激活，从而不可逆地抑制其激酶活性，对BTK的半数抑制浓度（median inhibitory concentration，IC50）为0.5 nmol/L，目前已在慢性淋巴细胞白血病、套细胞淋巴瘤、弥漫大B细胞淋巴瘤中显示了有效的体内外抗肿瘤活性。AVL-292(CC-292)是另一种新型的选择性BTK抑制剂，其作用机制与ibrutinib相似，但对BTK的IC50＜0.5 nmol/L。
　　浆细胞是终末分化阶段的B细胞，正常浆细胞中BTK表达量极低甚至无表达，但最近多个研究小组先后在MM患者肿瘤细胞和某些MM细胞系中检测出了BTK的表达。目前有关BTK抑制剂ibrutinib和AVL-292在MM中的研究报道尚少。
　　本研究旨在通过观察、比较两种BTK抑制剂ibrutinib和AVL-292对MM细胞增殖、凋亡的影响以及与临床常用蛋白酶体抑制剂硼替佐米的联合效应，并探讨其可能的效应机制，来明确BTK抑制剂在骨髓瘤治疗中的应用价值，以期为MM治疗提供新的靶点和联合用药方案。
　　方法:1、采用蛋白质印迹(Western blot)法检测人多发性骨髓瘤细胞系NCI-H929、RPMI8226细胞中BTK蛋白表达情况。不同浓度ibrutinib、AVL-292单药以及两药分别联合硼替佐米处理NCI-H929、RPMI8226细胞，采用CCK-8法检测细胞增殖，AnnexinⅤ-FITC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡，Western blot法检测药物处理前后细胞内BTK、NF-κB(p65)、AKT、ERK蛋白及其磷酸化水平，以及凋亡相关蛋白Bcl-xL、 cleaved（活化型）caspase-3的表达水平。2、密度梯度离心法分离MM患者骨髓单个核细胞，体外贴壁法培养骨髓间充质干细胞(bone marrowmesenchymal stem cells，BMSCs)，应用流式细胞术鉴定第3代BMSCs免疫表型;用成骨、成软骨、成脂诱导分化培养基培养BMSCs，然后分别用茜素红、阿利新蓝、油红O染色法检测培养获得的患者BMSCs的成骨、成软骨、成脂特性。3、用ibrutinib、AVL-292分别处理患者BMSCs，CCK-8法检测ibrutinib和AVL-292对BMSCs增殖的影响，荧光定量RT-PCR法检测ibrutinib和AVL-292对BMSCs中白介素-6(IL-6)基因mRNA表达水平的影响。建立MM细胞与BMSCs共培养体系，CCK-8法检测MM患者BMSCs对MM细胞系增殖的影响以及ibrutinib、AVL-292对共培养体系中NCI-H929细胞增殖的影响。
　　结果:1、NCI-H929、RPMI8226细胞中存在BTK蛋白表达。2、ibrutinib和AVL-292均可抑制NCI-H929、RPMI8226细胞增殖，其抑制作用呈浓度依赖性。在NCI-H929细胞，当ibrutinib浓度为10、50、100μmol/L，AVL-292浓度为5、10、50、100μmol/L时，24 h细胞活性与48 h细胞活性差异有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01)，呈现出时间依赖性。ibrutinib对NCI-H929、RPMI8226细胞48h的IC50分别为（10.41±3.29)μmol/L、（51.65±13.58)μmol/L;AVL-292对NCI-H929、RPMI8226细胞48 h的IC50分别为（7.77±2.99）μmol/L、（6.44±1.06）μmol/L。3、不同浓度的ibrutinib(5、10μmol/L)和AVL-292(5、10μmol/L)与不同浓度的硼替佐米（5、10、20、50 nmol/L）联合应用对NCI-H929、RPMI8226细胞的增殖抑制率均高于相应浓度单药组(P＜0.05，P＜0.01)，不同组合的协同系数R均大于1。4、10μmol/L ibrutinib、10μmol/L AVL-292和20 nmol/L硼替佐米单独作用48 h后，NCI-H929细胞的凋亡率分别为(16.47±2.70)％、(20.23±3.95)％和(12.40±1.06)％，均较对照组升高(P＜0.05，P＜0.01); RPMI8226细胞的凋亡率分别为(11.27±1.64)％、(17.50±3.70)％和（6.30±0.92）％，除硼替佐米外均较对照组升高(P＜0.05，P＜0.01);10μmol/L ibrutinib和10μmol/L AVL-292分别与20 nmol/L硼替佐米联合后，NCI-H929细胞凋亡率分别为(32.20±2.74)％和(38.70±5.03)％，RPMI8226细胞凋亡率分别为(26.60±1.51)％和(35.93±3.11)％，均显著高于相应单药组(P＜0.01）。5、10μmol/Librutinib单药和10μmol/L AVL-292单药作用24 h后，NCI-H929细胞内BTK、NF-κB(p65)、AKT和ERK的磷酸化水平和抗凋亡蛋白Bcl-xL表达水平降低，cleaved（活化型）caspase-3表达水平增加;与硼替佐米联合应用，两药对上述蛋白的调节作用均增强。6、成功获得MM患者骨髓间充质干细胞(MM-BMSCs)，流式免疫表型分析显示MM-BMSCs表达CD73、CD90和CD105，不表达造血细胞标记CD34和CD45;并且经诱导后，BMSCs可以向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞方向分化，具有间充质干细胞(MSCs)的特性。7、10μmol/L ibrutinib和10μmol/LAVL-292处理48 h后，初发／进展期和稳定期患者来源的BMSCs的增殖活性较对照组无明显变化(P＞0.05)，但初发／进展期BMSCs中IL-6 mRNA水平较对照组降低(P＜0.01)。8、NCI-H929、RPMI8226细胞与初发／进展期BMSCs共培养48 h后，细胞增殖活性较各自单独培养时升高（P＜0.01）;与稳定期BMSCs共培养后，细胞增殖活性与各自单独培养时无明显差异(P＞0.05)。9、ibrutinib和AVL-292均能抑制与初发／进展期BMSCs共培养的NCI-H929细胞的增殖，10μmol/Librutinib和10μmol/L AVL-292能完全阻断BMSCs对NCI-H929细胞的促增殖作用。
　　结论:1、BTK抑制剂ibrutinib和AVL-292对存在BTK表达的多发性骨髓瘤细胞系NCI-H929、RPMI8226有增殖抑制和凋亡诱导作用，并与蛋白酶体抑制剂硼替佐米有协同作用，其机制可能与抑制细胞内BTK激酶活性及下游NF-κB、AKT、ERK信号通路活性、下调抗凋亡蛋白Bcl-xL表达、激活caspase-3依赖的凋亡途径有关。2、Ibrutinib和AVL-292能够抑制与初发／进展期患者BMSCs共培养的NCI-H929细胞的增殖，阻断BMSCs对骨髓瘤细胞增殖的刺激作用;还能抑制初发／进展期患者BMSCs中IL-6基因mRNA的表达，但对BMSCs的增殖活性无明显影响。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一部分 Bruton’s酪氨酸激酶抑制剂对人多发性骨髓瘤细胞的作用

前言

材料与方法

结果

讨论

第二部分 Bruton’s酪氨酸激酶抑制剂联合硼替佐米对人多发性骨髓瘤细胞的作用及机制研究

前言

材料与方法

结果

讨论

第三部分 Bruton’s酪氨酸激酶抑制剂在骨髓间充质干细胞-骨髓瘤细胞共培养体系中的药效评估

前言

材料与方法

结果

讨论

全文总结

文献综述 Bruton’s酪氨酸激酶及其抑制剂ibrutinib的研究进展

参考文献

在读期间发表论文和参加科研工作情况说明

致谢