巨噬细胞移动抑制因子通过在人骨肉瘤中激活RAS_MAPK通路促进肿瘤生长和肺转移的研究

摘要

骨肉瘤（Osteosarcoma，OS）是一类经常发生在孩童与青少年中的原发恶性骨肿瘤。骨肉瘤患病率比较低，但是恶性程度却十分高，较易在早期发生肺转移，约有20%的骨肉瘤患者在首次就诊时就已发生肺转移，严重危害着青少年的健康，是青少年癌症患者死亡的主要原因之一。随着肿瘤研究的深入，越来越多的证据表明，肿瘤所处的微环境在促进癌症的发展以及转移当中具有十分关键的作用。 巨噬细胞移动抑制因子（Macrophage migration inhibitory factor，MIF）作为先天免疫系统的重要效应物，有助于肿瘤的发展和恶性转化，研究发现，MIF在多系统肿瘤中高表达，它具有促进肿瘤细胞增殖，肿瘤血管形成和肿瘤转移的作用。有研究表明MIF的表达水平和肿瘤患者的预后密切相关，但是MIF在骨肉瘤的发生发展中的机制并不很清楚。本研究证实，MIF的水平在骨肉瘤患者的组织和血清样品中显著增加，并且发现MIF表达与肿瘤大小、肺转移以及骨肉瘤患者的存活率相关；在骨肉瘤患者组织中发现MIF和p-ERK1/2水平之间呈正相关性；MIF可以在143B细胞和MNNG/HOS细胞中通过时间和剂量依赖性方式激活RAS/MAPK通路，从而促进细胞增殖和迁移；此外，通过慢病毒转染构建了MIF基因沉默的稳转143B和MNNG/HOS骨肉瘤细胞系，应用CCK-8试剂盒、流式细胞术、Transwell小室和qRT-PCR等方法，研究发现MIF基因沉默之后，两种骨肉瘤细胞的增殖活性，抗凋亡能力和迁移能力均受到明显抑制，而且，在动物实验中，MIF的下调可以显著抑制小鼠异种移植和原位模型中骨肉瘤的生长和肺转移。我们的研究结果表明，在骨肉瘤进展和由MIF触发的RAS/MAPK通路的激活期间，MIF可能是一个重要的细胞因子，这可能是骨肉瘤生长和肺转移的重要机制之一。MIF可能是一个有前途的诊断和治疗骨肉瘤的新靶点。本文主要分为以下几个部分: 第一部分：MIF在骨肉瘤患者组织和血清中的表达及意义研究 目的：研究MIF在骨肉瘤患者肿瘤组织及血清中的表达，探讨MIF的表达与肿瘤大小、肺转移以及骨肉瘤患者的存活率之间的关系。 方法：从2008年至2012年在金陵医院（南京，中国）进行根治性切除术的骨肉瘤患者中获得60组肿瘤组织和成对的正常邻近组织（normal adjacent tissues，NAT）。手术切除的组织在液氮中快速冷冻，分析时取出。35名患者的血清样品在诊断时获得，另选择被证实没有疾病的35名志愿者作为健康对照，通过ELISA测试OS患者及对照组的血清MIF水平。为了研究MIF表达与生存情况的相关性，对60个OS患者进行了自诊断以来为期三年的随访。 结果：通过HE染色初步检查60对配对的OS和NAT组织，然后使用特异性抗MIF抗体进行IHC染色，以检测60名患者的组织中MIF的水平。发现38例（63.3％）显示MIF的高表达（具有超过20％的MIF阳性细胞），22例（36.7％）显示MIF的低表达（具有小于20％的MIF阳性细胞）。另外，从38个具有高表达MIF的病例中随机选择8个配对组织，进行Western印迹检测，结果表明，与正常相邻组织相比，OS组织中MIF的显著增加，这与IHC染色的结果一致。 结论：MIF的上调在OS的组织和血清样品中频繁发生，并且可能与OS患者的肿瘤大小和肺转移密切相关。 第二部分：MIF通过在骨肉瘤细胞中激活RAS_MAPK通路促进肿瘤生长和肺转移 目的：通过MIF刺激骨肉瘤细胞后，检测ERK1/2的磷酸化水平以及RAS/MAPK通路下游的细胞增殖标志物（KI-67和PC??NA）和转移相关基因（MMP-9，MMP-13和VEGF）的变化，探讨MIF促进骨肉瘤生长与转移的机制。 方法：将MNNG/HOS和143B细胞（2×105）接种在6孔板中，并在含有10％FBS的MEM培养基中培养12小时。用PBS洗涤细胞并用无血清MEM改变12小时，然后用不同浓度（0,50,100ng/mL）的rMIF孵育不同时间（0分钟，10分钟，30分钟，2小时，6小时）。之后，收集细胞用于总-ERK1/2和p-ERK1/2的western分析。此外，在存在或不存在10mM U0126（MEK1/2抑制剂，Sigma-Aldrich）的情况下，细胞用浓度为100ng/mL的rMIF孵育2小时，用于后续蛋白质和RNA分析。 结果：MIF在时间和剂量依赖性上诱导ERK1/2的磷酸化：MIF刺激后，100ng/mL的浓度下，在30分钟时检测到增强的p-ERK1/2，MIF处理2小时后，在143B和MNNG/HOS细胞中观察到ERK1/2的最显著的磷酸化。因此，在以下测定中使用100ng/mL的处理条件2小时。采用Western印迹法检测p-SRC，总SRC，RAS-GTP，总RAS，p-MEK1/2，总MEK1/2，p-ERK1/2和总ERK1/2的表达。用MIF刺激的143B和MNNG/HOS细胞中的总SRC，RAS，MEK1/2和ERK1/2的水平与对照组相比没有显著改变。 结论：MIF可能通过激活RAS/MAPK通路来促进骨肉瘤进展。 第三部分：下调MIF抑制骨肉瘤细胞的增殖和转移能力的研究 目的：通过干扰RNA技术建立稳定转染的抑制MIF表达的细胞系，研究骨肉瘤细胞增殖和转移能力的变化，进一步探讨MIF影响骨肉瘤发展与转移的机制。 方法：建立稳定抑制MIF表达的MNNG/HOS和143B细胞（shRNA-MIF-LV-143B和shRNA-MIF-LV-MNNG/HOS）及其对照细胞（shRNA-NC-LV-143B和shRNA-NC-MNNG/HOS），观察各组细胞中MIF,PCNA，KI-67，MMP-9，MMP-13和VEGF的mRNA水平变化。 结果：在shRNA-MIF-LV感染后，在143B细胞中MIF的mRNA表达降低75.5％，在MNNG/HOS细胞中mRNA表达降低66.4％。而在143B细胞中，MIF的蛋白表达降低了84.1％，在MNNG/HOS细胞中MIF的蛋白表达降低了71.9％，而在shRNA-MIF-LV感染后，p-ERK的表达在143B细胞中减少了56.2％，在MNNG/HOS细胞中减少了41.1％。与对照组细胞相比，在稳定抑制MIF表达的143B或MNNG/HOS细胞中细胞增殖以时间依赖性方式受到抑制。 结论：MIF干扰可以显著抑制骨肉瘤细胞的增殖和转移能力。 第四部分：下调MIF抑制骨肉瘤生长与转移的体内研究 目的：构建用于观察骨肉瘤生长的小鼠异种移植模型和用于监测骨肉瘤自发肺转移的原位小鼠模型，研究下调MIF对骨肉瘤生长与转移的影响。 方法：构建用于观察骨肉瘤生长的小鼠异种移植模型，将动物平均分为4组（每组7只小鼠），并向其右侧皮下注射5×106个活的shRNA-MIF-LV-143B细胞，shRNA-MIF-LV-MNNG/HOS细胞或其对照细胞。在皮下植入细胞后，每天观察动物的肿瘤生长。在第9,12,15,18,21,24,27和30天测量肿瘤。在植入后30天处死小鼠，然后切除异种移植肿瘤，拍照并称重。构建用于监测骨肉瘤自发肺转移的原位小鼠模型，将具有MIF稳定抑制表达的143B细胞或对照细胞与荧光素酶报道基因生长至接近汇合。然后将细胞悬浮液（20μl;1×106个细胞/mL PBS）经皮注射到麻醉的裸鼠的胫骨中。每组包含8只小鼠。通过生物发光成像在1周，3周，5周监测骨肉瘤肺转移的发展。五周后，处死动物，收集获得肺结节及周围的肺组织并在10％福尔马林溶液中固定。用HE染色的5μm石蜡包埋的切片上置于显微镜上观察肺转移。 结果：在观察骨肉瘤生长的小鼠异种移植模型中，shRNA-MIF-LV组中的肿瘤大小显著小于shRNA-NC-LV组中的肿瘤大小。在植入后30天，与shRNA-NC-LV-143B组相比，shRNA-MIF-LV-143B组切除的肿瘤重量减轻了82.5％。类似的，与对照组相比，shRNA-MIF-LV-MNNG/HOS组中的肿瘤重量降低了86.3％。在用于监测骨肉瘤自发肺转移的原位小鼠模型中，在用细胞接种后1周，仅在每组的原发性损伤处检测到来自荧光素酶生物发光的信号，但在肺部区域中未检测到信号。在第3周时，来自shRNA-NC-LV-143B组的8只小鼠中的2只在肺部区域中显示信号，表明转移性病变。但在shRNA-MIF-LV组中没有检测到相似的信号。在第27天，shRNA-NC-LV组的8只小鼠中的1只死亡，并通过尸检证实肺转移。在5周时，通过IVIS成像系统在来自shRNA-NC-LV组的所有7只活的小鼠中检测到肺转移。 结论：MIF的下调可以显著抑制骨肉瘤的体内生长以及减弱OS的肺转移，表明MIF可能是治疗OS的一个有意义的靶点。

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