C型凝集素受体Dectin3在脓毒症中的作用机制及防治策略研究

摘要

脓毒症(sepsis)是指病原微生物入侵机体后所致的全身炎症反应综合症(systemicinflammatory response syndrome，SIRS)，其病原体包括细菌、真菌、寄生虫及病毒等。重症脓毒症(severe sepsis)、感染性休克(septic shock)和多器官功能障碍综合症(multipleorgan disfunction syndrome，MODS)是脓毒症渐进性发展的后续症。目前，脓毒症已被列为致死率前十的疾病之一，每年约有1900万人发病。高发病率和高死亡率使得脓毒症成为维护公众健康的主要压力。因此，明确引起脓毒症的病原体及其发病机制对于预防和治疗脓毒症具有重要的意义。
　　机体固有免疫系统对病原体的反应程度是引发脓毒症的关键因素，免疫炎症反应的失衡被认为是脓毒症的核心表现，过度的免疫激活在清除病原体之余导致器官功能损害甚至带来致死性的结果。在正常情况下，固有免疫系统模式识别受体特异识别病原体，激活固有免疫细胞内信号级联反应，释放多种炎症细胞因子启动固有和适应性免疫应答清除感染。研究发现脓毒症与遗传有关，免疫应答通路中关键基因的变异能够影响机体免疫系统对病原体的反应程度。因此，寻找与脓毒症发生发展相关的免疫基因将有利于发展新的基因诊断技术，筛查临床脓毒症的高危患者，以及发现新的药物和治疗靶点，防治脓毒症，改善脓毒症患者的预后。
　　目前研究报道，模式识别受体家族中C型凝集素受体(C-type lectin receptors，CLRs)能够特异识别真菌和细菌，激活Syk-CARD9-NF-κB通路，释放炎症因子清除病原菌的感染。如CLRs中Dectin1识别真菌表面葡聚糖，Dectin2识别真菌表面甘露糖和细菌表面甘露糖化的脂多糖，Dectin3和Mincle识别并结合分歧杆菌表面海藻糖二霉菌酸酯等。本课题拟利用Dectin1、Dectin3及CARD9敲除小鼠，探讨CLRs及其下游接头蛋白CARD9在脓毒症发生发展中的作用及机制。
　　本课题采用国际公认的脓毒症模型“金标准”——盲肠结扎穿孔法(cecal ligationand puncture，CLP)制备小鼠脓毒症模型。主要通过结扎部分盲肠并穿孔，造成局部坏死和肠内容物泄露，引起腹腔感染，造成脓毒症。本课题结果，显示脓毒症的严重程度受盲肠的结扎部位及穿刺针的孔径影响;进一步研究结果显示，随着穿刺针孔径的增加，小鼠肺及腹腔病原菌数量显著升高，炎症因子TNF-α的水平显著增加。利用CLP方法在野生型、Dectin1、Dectin3和CARD9敲除小鼠中制备脓毒症模型，结果发现轻度盲肠结扎并用小直径针头穿孔后，野生型小鼠在观察的7天中全部存活，而Dectin3敲除小鼠在手术后48小时内全部死亡，但Dectin1与CARD9敲除小鼠在手术后的死亡率及中位生存时间与野生型小鼠没有显著差异。结果提示，Dectin3是小鼠发生脓毒症的关键受体。进一步对脓毒症模型小鼠的肺匀浆液及腹腔灌洗液进行细菌及真菌培养，发现细菌培养呈阳性，真菌培养呈阴性，表明该动物模型为细菌感染脓毒症模型。对小鼠肺匀浆液及腹腔灌洗液中荷菌量的分析结果显示，Dectin3敲除小鼠的肺部及腹腔内细菌量与野生型小鼠相比显著增加。利用ELISA方法检测小鼠局部（肺部及腹腔灌洗液）及全身（血清）的炎症水平，结果显示Dectin3敲除小鼠的肺部与腹腔内炎症因子TNF-α较野生型小鼠显著升高，其他炎症因子如IL-6、IL-12、IL-1β的产生量与野生型小鼠没有明显差异。病理分析结果显示，Dectin3敲除小鼠肺组织经HE染色后可见肺泡壁增厚，结构消失，炎症反应严重。流式细胞计数结果显示，Dectin3敲除小鼠手术后12小时的肺部中性粒细胞的数量及比例显著减少。上述结果提示Dectin3在识别及清除细菌，降低脓毒症对机体的损伤中发挥着重要的作用;而Dectin1、CARD9在脓毒症小鼠的免疫保护反应中可能没有发挥作用。
　　利用PCR扩增细菌16S rRNA全长序列，测序并进行blast比对鉴定Dectin3敲除小鼠肺部细菌的种类，结果显示，受检细菌中91％为大肠杆菌，其余为弗氏志贺菌。比对结果提示大肠杆菌血清型可能为O83∶ H1。进一步设计引物扩增该菌株特异毒力因子编码基因ibeA、fimH和fimA，测序比对结果显示该菌株是大肠杆菌O83∶H1str.NRG857c;提示Dectin3受体可能识别该血清型大肠杆菌。下文将该菌株称为“大肠杆菌O83∶H1”。
　　体外实验用上述分离获得的大肠杆菌O83∶H1刺激小鼠的骨髓巨噬细胞(bonemarrow derived macrophage，BMDM)，ELISA检测BMDM产生的细胞因子水平，发现Dectin3敲除小鼠的BMDM细胞经大肠杆菌O83∶H1刺激后，产生TNF-α和IL-1β的水平显著低于野生型小鼠的BMDM细胞，表明Dectin3是该大肠杆菌的特异识别受体。利用NF-κB和ERK信号通路抑制剂与大肠杆菌O83∶ H1共刺激野生型小鼠的BMDM细胞，检测细胞因子TNF-α的产生量，结果显示，抑制了Syk、p65后，TNF-α的产生量明显降低，与单纯大肠杆菌O83∶ H1刺激组的差异有统计学意义，表明Dectin3识别大肠杆菌O83∶H1后，通过激活NF-κB信号通路发挥作用。而从其他血清型大肠杆菌中提取的脂多糖刺激两种细胞产生的TNF-α水平没有显著差异。腹腔注射脂多糖模拟脓毒症，观察小鼠的生存率，结果显示，野生型小鼠与Dectin3敲除小鼠对脂多糖的反应性没有明显差异，生存率的差异没有统计学意义，表明Dectin3只能识别大肠杆菌中的O83∶ H1血清型，而不能识别其他血清型。
　　本实验室前期研究发现，月季花提取物体外具有抗真菌作用，灌胃给药明显延长系统性真菌感染小鼠的生存时间。本课题构建了真菌感染脓毒症模型，小鼠饮用含有抗生素的灭菌水以破坏肠道内细菌菌落平衡，于造模前先后灌胃给予月季花提取物及白念珠菌，观察小鼠的生存率。结果显示，月季花提取物可以降低真菌感染脓毒症小鼠的死亡率，并且在细菌脓毒症造模前灌胃给予月季花提取物可以明显降低细菌感染脓毒症小鼠的死亡率，延长生存时间，表明月季花提取物不仅对真菌感染脓毒症小鼠有保护作用，对细菌感染脓毒症小鼠也有保护作用。进一步体外药敏实验检测大肠杆菌O83∶ H1对抗菌药的敏感性，结果显示大肠杆菌O83∶ H1对临床使用的抗菌药均表现为敏感，对月季花提取物表现为耐药，提示由大肠杆菌O83∶H1引起的感染可使用常规的抗菌药治疗。
　　本课题首次发现Dectin3基因与小鼠脓毒症的严重程度有关，敲除小鼠的Dectin3基因后，可降低脓毒症小鼠的生存率;同时发现Dectin3可以识别血清型为O83∶H1的大肠杆菌，激活NF-κB信号通路，发挥抗细菌感染的作用;并且Dectin3在识别细菌发挥免疫过程中，不需要CARD9的参与。

目录

声明

摘要

英文缩略词表

前言

第一部分 小鼠脓毒症模型的建立及评价

一、实验材料与方法

二、实验结果

讨论

第二部分 CLRs在脓毒症中的作用及机制研究

一、材料与方法

二、实验结果

讨论

第三部分 脓毒症的药物治疗

一、实验材料与方法

二、实验结果

讨论

总结

附录

参考文献

综述

在读期间发表的论文

在读期间承担科研项目情况

致谢