烟酰胺的抗真菌增效作用及其分子机制研究

摘要

侵袭性真菌感染由于其高发病率和高死亡率，至今仍然是临床上的重要负担，其中白色念珠菌是导致念珠菌血症等侵袭性真菌感染疾病的主要病原体。然而现有的抗真菌药物种类少、副作用多，而且其研发速度也赶不上真菌耐药的速度，寻找新颖的抗真菌药物或现有抗真菌药物的增效剂越来越重要。
　　烟酰胺（维生素B3）作为临床上治疗糙皮病的药物，在近年来被临床研究证实为能治疗皮肤癌、共济失调的有效药物。此外，体外实验已经证明烟酰胺能够在体外抑制多种真菌的生长，故本研究探索烟酰胺是否能作为抗真菌药物的增效剂，以期减轻临床上治疗侵袭性真菌感染的负担。
　　药物敏感性实验显示，烟酰胺能有效增强紫草素、氟康唑、两性霉素B及卡泊芬净对白念珠菌的作用，还能减轻唑类药物的拖尾现象。棋盘式微量液基稀释法证明，烟酰胺能协同上述药物抗临床耐药的白色念珠菌、耐卡泊芬净的白色念珠菌、热带念珠菌及新生隐球菌的作用。
　　通过构建小鼠系统性念珠菌感染的模型，联合使用烟酰胺和抗真菌药物进行考察。结果显示烟酰胺能有效增强氟康唑、卡泊芬净治疗小鼠系统性念珠菌感染的作用，使得小鼠生存率显著提高。小鼠肾脏病理切片结果证实烟酰胺与氟康唑、卡泊芬净联用还能减轻白念珠菌造成的肾脏炎症反应、菌丝侵袭等情况。烟酰胺与卡泊芬净联用的体内治疗效果呈现一定的剂量依赖性。此外，烟酰胺还能一定程度上增强两性霉素B治疗系统性念珠菌感染的作用。
　　免疫印迹法证实，紫草素通过抑制去乙酰化相关基因HST3的作用从而诱导白念珠菌组蛋白H3上56位赖氨酸过度乙酰化，进而协同烟酰胺抗真菌，而氟康唑、两性霉素B及卡泊芬净均不能诱导H3上56位、9位及18位赖氨酸的过度乙酰化。运用流式细胞仪我们发现，烟酰胺能诱导白念珠菌一定程度的凋亡，并且能显著改变细胞周期，使得G1期或S期发生阻滞，这些作用有助于其协同抗真菌药物抗真菌。运用激光共聚焦显微镜、透射电子显微镜、絮凝试验及细胞表面疏水性实验等方法，我们发现烟酰胺通过抑制HST3的功能，从而导致白色念珠菌细胞壁上甘露糖含量减少、几丁质含量增加、β-(1，3)-glucan暴露以及细胞壁松弛、细胞膜皱缩及边缘模糊、胞浆内细胞器边缘模糊、真菌絮凝能力增强、细胞表面疏水性增加，进而协同抗真菌药物抗真菌。此外，通过微量液基稀释法筛查细胞壁相关基因缺失菌的菌库，我们发现烟酰胺对细胞壁的影响与GIN4基因密切相关。
　　进一步的，我们通过代谢组学研究发现，烟酰胺能影响白念珠菌氨基酸代谢、三羧酸循环、氮代谢、糖酵解、磷酸戊糖途径等。特别的，烟酰胺还能导致白念珠菌胞内多胺含量的增多，而多胺与多胺合成抑制剂均能抑制烟酰胺抗白念珠菌的作用，精氨酸和鸟氨酸对烟酰胺的抗真菌作用没有显著影响，这提示多胺合成的通路中的鸟氨酸脱羧酶或其编码基因很可能在烟酰胺的增效过程中起了重要作用。
　　综上所述，本课题研究证实烟酰胺能作为有效增强抗真菌药物治疗侵袭性真菌感染的增效剂，该增效剂通过多重机制增强抗真菌药物的作用，尤其是其抑制HST3功能从而影响细胞壁完整性的机制有助于开发新颖的抗真菌药物或抗真菌药物增效剂。

目录

声明

摘要

缩略词

前言

第一部分 烟酰胺联合抗真菌药物体外抗真菌作用研究

一、实验材料和方法

(一)受试菌株

(二)真菌培养基

(三)药物与溶剂

(四)仪器设备

(五)药物敏感性实验

(六)棋盘式微量液基稀释法

二、实验结果

(一)药物敏感性实验

(二)棋盘式微量液基稀释法

三、讨论

第二部分 烟酰胺联合抗真菌药物治疗侵袭性真菌感染的研究

一、实验材料和方法

(一)受试菌株

(二)真菌培养基

(三)药物与溶剂

(四)仪器设备

(五)小鼠系统性念珠菌感染生存率实验

(六)小鼠系统性念珠菌感染病理切片实验

(七)统计学分析

二、实验结果

(一)烟酰胺增强系统性念珠菌感染小鼠生存率

(二)烟酰胺与氟康唑、卡泊芬净联用对念珠菌感染小鼠肾脏组织的作用

三、讨论

第三部分 烟酰胺抗真菌药增效作用的分子机制

一、实验材料和方法

(一)受试菌株

(二)真菌培养基

(三)药物与试剂

(四)仪器设备

(五)免疫印迹法(Western Blot)考察组蛋白乙酰化变化

(六)烟酰胺对白念珠菌渗透的影响

(七)烟酰胺对白念珠菌ROS产生的影响

(八)烟酰胺对白念珠菌凋亡的影响

(九)烟酰胺对白念珠菌细胞周期的影响

(十)细胞壁干扰药物对烟酰胺的作用

(十一)细胞壁干扰药物对HST3缺失菌的作用

(十二)烟酰胺对白念珠菌细胞壁多糖成分的影响

(十三)透射电镜观察烟酰胺对白念珠菌细胞壁的作用

(十四)烟酰胺对白念珠菌疏水性及絮凝的影响

(十五)HST3基因缺失对白念珠菌细胞壁多糖的影响

(十六)透射电镜观察HST3基因缺失对白念珠菌细胞壁的作用

(十九)gin4Δ／Δ5对烟酰胺的敏感性实验

(二十)统计学分析

二、实验结果

(一)紫草素能诱导白念珠菌H3K56ac水平升高

(二)紫草素抑制HST3功能从而升高H3K56ac水平

(三)氟康唑对白念珠菌组蛋白H3不同位点乙酰化水平没影响

(四)两性霉素B对白念珠菌组蛋白H3不同位点乙酰化水平没影响

(五)卡泊芬净对白念珠菌组蛋白H3不同位点乙酰化水平没影响

(六)烟酰胺不能改变白念珠菌的渗透性

(七)烟酰胺不能诱导白念珠菌活性氧(ROS)的产生

(八)烟酰胺能增加白念珠菌凋亡水平

(九)烟酰胺影响白念珠菌细胞周期

(十)细胞壁干扰药物增强烟酰胺作用

(十一)烟酰胺影响白念珠菌细胞壁多糖的合成

(十二)烟酰胺对白念珠菌超微结构的影响

(十三)烟酰胺增强白念珠絮凝及疏水性

(十四)HST3基因缺失菌对细胞壁干扰药物更敏感

(十五)HST3基因缺失影响白念珠菌细胞壁多糖

(十六)HST3基因缺失影响白念珠菌细胞超微结构

(十七)HST3基因缺失影响白念珠菌絮凝及疏水性

(十八)GIN4基因缺失菌株对烟酰胺敏感性显著增加

三、讨论

第四部分 代谢组学考察烟酰胺的机制及多胺合成通路对烟酰胺作用的影响

一、实验材料和方法

(一)受试菌株

(二)真菌培养基

(三)药物与溶剂

(四)仪器设备

(五)代谢组学研究

(六)多胺对烟酰抗真菌作用的影响

(七)多胺合成抑制剂对烟酰抗真菌作用的影响

(八)精氨酸及鸟氨酸对烟酰抗真菌作用的影响

二、实验结果

(一)代谢组学结果

(二)多胺抑制烟酰胺的抗真菌作用

(三)多胺合成抑制剂抑制烟酰胺的抗真菌作用

(四)精氨酸及鸟氨酸不影响烟酰胺的抗真菌作用

三、讨论

总结

参考文献

综述白色念珠菌生物被膜形成过程中的氨基酸生物标志物

在读期间发表论文和参加科研工作情况

致谢