核内不均一性核糖核蛋白A2/B1对LPS诱导的血管内皮细胞损伤的影响及作用机制

摘要

脓毒症是由于宿主对病原体感染的反应失调引起的危及生命的器官功能障碍。脓毒症性休克和脓毒症ARDS作为最严重的临床表现形式，常伴有严重低血压，微血管灌注不足和组织缺氧，最终导致多器官功能衰竭。由于脓毒症发生机制尚未完全明确，脓毒症仍局限于液体复苏和对症支持等治疗，多年来死亡率一直居高不下。血管内皮功能障碍是脓毒症发生的主要因素。脓毒症发生时，血管内皮一旦被激活，其迅速变为促凝，抗纤维化和促粘附的状态。脓毒症时血管内皮激活与微循环血流变化，血管通透性改变，白细胞聚集及炎症反应相关。因此，血管内皮在脓毒症发生中扮演重要角色，可以作为脓毒症治疗的潜在靶点。
　　近年来，核内不均一性核糖核蛋白A2/B1(heterogeneous nuclear ribonucleoproteinsA2/B1，hnRNP A2/B1)的研究受到广泛关注。作为核内不均一性核糖核蛋白家族的分子，hnRNPA2/B1在mRNA剪接，核-胞质转运，转录后调控，染色体稳定性调控等方面发挥重要作用。同时，hnRNP A2/B1可调节细胞生物学功能，如调节细胞代谢，迁移和侵袭，增殖和线粒体应激等。研究发现hnRNP A2/B1可通过调节CDKs抑制因子p16INK4a、P21、P27的转录水平，参与对细胞周期的调控。最近，有研究发现hnRNP A2/B1通过调节E-cadherin表达参与肺癌上皮细胞间充质转化。同时，在胰腺肿瘤组织中，hnRNP A2/B1的蛋白表达水平与E-cadherin表达缺失呈正相关。但hnRNP A2/B1在脓毒症血管内皮损伤中是否发挥作用尚未见报道。
　　本研究主要通过LPS刺激人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)构建脓毒症血管内皮损伤的模型，探寻hnRNP A2/B1在脓毒症所致血管内皮损伤中发挥的作用及其可能机制。首先，研究hnRNP A2/B1在LPS刺激时对血管内皮细胞功能的影响;然后在明确hnRNP A2/B1对血管内皮发挥保护作用的基础上，进一步探讨hnRNP A2/B1发挥血管内皮保护功能的可能机制。
　　第一部分:hnRNP A2/B1对LPS诱导的血管内皮细胞损伤的影响
　　目的:
　　研究hnRNP A2/B1对LPS诱导的血管内皮细胞损伤的影响。
　　方法:
　　利用siRNA转染技术沉默hnRNP A2/B1，研究在LPS诱导的HUVECs损伤时沉默hnRNP A2/B1对内皮功能的影响。实验分为四组:①hnRNP A2/B1 siRNA组②Negative control(NC) siRNA组③hnRNP A2/B1 siRNA-LPS组④NC siRNA-LPS组，经处理后利用内皮细胞跨膜电阻抗(TEER)和FITC-葡聚糖通透实验研究内皮细胞通透性改变，利用划痕和Transwell迁移实验研究内皮细胞迁移功能改变，利用Westernblot方法检测内皮细胞相关粘附分子的表达改变。
　　结果:
　　1、利用siRNA转染HUVEC后，RT-PCR和Western blot显示hnRNP A2/B1siRNA-664组hnRNP A2/B1的mRNA和蛋白表达水平均明显低于NC-siRNA组，差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　2、LPS刺激HUVEC12h后，NC siRNA-LPS组TEER值较NC siRNA组明显下降，hnRNPA2/B1 siRNA-LPS组TEER值较NC siRNA-LPS组进一步降低(P＜0.05)。同时，NC siRNA-LPS组FITC-葡聚糖的荧光强度高于NC siRNA组，hnRNPA2/B1 siRNA-LPS组FITC-葡聚糖的荧光强度较NC siRNA-LPS组明显升高(P＜0.05)。
　　3、划痕实验中，hnRNP A2/B1 siRNA-LPS组细胞迁移距离较NC siRNA-LPS组明显降低(P＜0.05)，Transwell迁移实验中，hnRNP A2/B1 siRNA-LPS组细胞迁移数量较NC siRNA-LPS组明显减少（P＜0.05）。
　　4、LPS处理后，NC siRNA-LPS组VE-Cadherin蛋白表达较NC siRNA组减少，hnRNP A2/B1 siRNA-LPS组VE-Cadherin表达较NC siRNA-LPS组明显下调(P＜0.05);同时，NC siRNA-LPS组ICAM-1蛋白表达较NC siRNA组增加，hnRNP A2/B1siRNA-LPS组ICAM-1表达较NC siRNA-LPS组明显上调(P＜0.05）。
　　结论:
　　在LPS刺激HUVECs诱导的血管内皮损伤中，沉默hnRNP A2/B1明显增加血管内皮通透性，阻碍血管内皮相关的细胞迁移能力，上调细胞间粘附分子ICAM-1和抑制血管内皮钙黏蛋白VE-Cadherin产生，加重血管内皮屏障功能的破坏。提示:hnRNPA2/B1在脓毒症诱导的血管内皮损伤中发挥保护作用，其表达可能有助于减轻血管屏障的损伤程度。
　　第二部分:hnRNP A2/B1对LPS诱导的血管内皮细胞损伤保护作用的可能机制
　　目的:
　　研究hnRNP A2/B1对LPS诱导的血管内皮细胞损伤产生保护作用的可能机制。
　　方法:
　　实验分为四组:①hnRNP A2/B1 siRNA组、②Negative control(NC) siRNA组、③hnRNP A2/B1 siRNA-LPS组、④NC siRNA-LPS组，在LPS处理HUVEC12h后，利用Western blot方法检测不同实验组中β-catenin、Src、Cdc42等信号分子的表达改变。
　　结果:
　　hnRNP A2/B1 siRNA-LPS组β-catenin表达低于NC siRNA-LPS组(P＜0.05);与NC siRNA-LPS组相比，hnRNP A2/B1 siRNA-LPS组的Src分子磷酸化表达水平上调(P＜0.05)，而Cdc42分子磷酸化表达水平无明显差异。
　　结论:
　　hnRNP A2/B1可能通过上调β-catenin表达及抑制Src磷酸化发挥内皮保护作用，从而保护脓毒症肺损伤时血管内皮屏障的相关功能。

目录

声明

摘要

主要英文缩略词

前言

第一部分 hnRNP A2／B1对LPS诱导的内皮细胞损伤的影响

材料与方法

结果

讨论

第二部分 hnRNP A2／B1对LPS诱导的血管内皮细胞损伤保护作用的可能机制

材料与方法

结果

讨论

全文总结

参考文献

综述 内皮屏障功能的调节机制

在读期间发表论文和参加科研工作情况

致谢