慢性炎症诱导的肝前体细胞向肝癌干细胞转化及其与索拉菲尼治疗的相关研究

摘要

研究背景和目的：
　　肝癌是具有高度异质性的复杂物，这为肝癌干细胞的存在提供了理论依据。早期的证据已经说明了肝癌干细胞的扩增有助于肝癌的发生。大量的研究证实肿瘤干细胞具有很强的肿瘤起始的能力、自我更新的能力、较强的转移能力、化疗抵抗以及促进血管生成的能力。与肝癌干细胞相比，肝前体细胞(LPC Hepatic progenitorcell)主要分布在成人的肝脏组织中，具有有限的自我更新能力和较低的分化潜能。肝前体细胞又叫卵圆细胞，主要是分布在肝脏的赫林氏管上的正常上皮细胞。有文献报道OV6或者CK19可以作为LPC特有的标志物，LPC具有向肝实质细胞和胆管细胞双向分化的能力，当发生组织损伤或者炎症时被激活，但只有当发生迁延不愈的炎症刺激时才会产生代偿性的扩增。大量的研究表明LPC的活化扩增可以明显的促进其恶性转变，这可能是由LPC转变成肝癌干细胞的最直接证据。然而在慢性炎症导致肝癌发生的过程中，LPC是否转变成肝癌干细胞的现象及机制并不明确，仍需进一步探究。
　　目前肝癌的常规治疗包括肝癌切除术、肝脏移植、射频消融和经动脉化疗栓塞术等。然而这些常规的治疗方式并不能有效的去除肝癌干细胞，因此肝癌的复发率仍然较高。随着小分子靶点药物的研究不断深入，越来越多的靶点药物开始应用于肿瘤的治疗中去。索拉菲尼作为目前唯一被批准用于晚期肝癌治疗的小分子化合物，已经广泛用于晚期肝癌患者的临床治疗。索拉菲尼在体外激酶抑制实验结果表明，索拉菲尼可以有效的抑制VEGFR1-3、PDGFRβ、C-kit、B-Raf、 Raf-1和Flt3等靶点分子。近期有文献报道索拉菲尼可以通过抑制STAT3的磷酸化从而抑制胆管癌的发生。
　　为了去探寻慢性炎症在LPC向肝癌干细胞转化过程中的作用，我们利用大鼠DEN诱癌模型模拟了在肝癌发生过程中随着炎症的加重，LPC的活化扩增更加明显，这一现象到肝硬化阶段更为突出。有趣的是清除大鼠体内的巨噬细胞后抑制了CK19和OV6双阳性这种可能LPC来源的肝癌发生。我们进一步研究发现TNF-α可以通过调节UBD和Chk2的表达，从而引起了染色体的不稳定性，这可能是肝前体细胞发生恶性转变的原因。临床病理指标及预后信息分析证明CK19和OV6双阳性的肝癌患者预后更差，并且对索拉菲尼治疗更为敏感。因此我们的结果不仅阐明了慢性炎症导致LPC向肝癌干细胞恶性转变的分子机制，同时还提出了一种全新的分子分型，为索拉菲尼的临床应用提供了指导。
　　研究方法:
　　1.利用免疫组织荧光共染的方法检测人的肝脏组织（正常肝、纤维化/肝硬化、肝癌癌旁）中LPC标志物CK19和OV6的表达情况，观察在肝癌发生各个阶段中LPC扩增情况。
　　2.给SOX9-CreERT2 DTR-eGFP示踪小鼠腹腔注射DEN和CCl4试剂，建立DEN+CCl4肝癌发生模型，对肝癌组织利用H&E和免疫组化染色检测α-SMA和GFP的表达情况，观察该小鼠模型在肝癌阶段中LPC扩增情况。
　　3.给大鼠注射DEN试剂，建立大鼠肝癌发生模型，通过免疫组化的方法对大鼠肝癌发生各个阶段的肝脏组织（正常肝、纤维化/肝硬化、肝癌癌旁）中CK19和OV6的表达情况进行检测，观察在大鼠肝癌发生各个阶段LPC扩增情况。
　　4.对分选出来的OV6阳性的LPC进行RT-PCR检测成熟的肝细胞标志物(Ttr、Alb)和胆系标志物(CD133、CK19、SOX-9、CD90)的mRNA的表达情况，观察OV6阳性的LPC是否为前体源性。
　　5.对原代LPC种植在NOD/SCID小鼠皮下的成瘤组织分别进行H&E染色、免疫组化检测AFP的表达和免疫荧光共染检测CK19（红色荧光）和OV6（绿色荧光）的表达情况，鉴别荷瘤组织是否为LPC源性的肝癌组织。
　　6.对大鼠肝硬化阶段的组织进行H&E染色分析和免疫组化方法检测CD68、TNF-α、IL-6的表达情况，观察大鼠诱癌肝硬化阶段组织的炎症浸润和炎性因子的表达。
　　7.通过尾静脉注射GdCl3的方法建立大鼠巨噬细胞清除模型，利用免疫组化方法检测肝癌组织中CK19和OV6的表达情况，统计CK19和OV6双阳性的肝癌比例。
　　8.对大鼠和小鼠的原代肝细胞以及肝前体细胞系(WB、LEPC)进行IL-6Rα、IL-6Rβ和TNFR免疫蛋白印迹检测，观察IL-6Rα、IL-6Rβ和TNFR的表达情况。
　　9.将TNF-α长期作用的WB细胞种植于NOD/SCID小鼠皮下，对其成瘤的组织进行H&E染色、免疫组化检测AFP的表达和免疫荧光共染检测CK19（红色荧光）和OV6（绿色荧光）的表达情况，观察荷瘤组织是否为LPC来源的肝癌。
　　10.利用体内有限稀释的方法，观察TNF-α长期作用的WB-F344和LEPC细胞系在NOD/SCID小鼠皮下的成瘤能力。
　　11.利用流式细胞检测技术分析TNF-α长期作用的WB-F344和LEPC细胞系中CD90和EpCAM的表达情况，观察炎症因子TNF-α长期作用是否促进LPC向肝癌干细胞转变。
　　12.对TNF-α长期作用的WB-F344和LEPC细胞进行染色体核型分析检测，分析WB-F344和LEPC细胞的染色体数目，研究TNF-α长期作用的WB-F344和LEPC细胞是否发生了染色体不稳定性。
　　13.利用蛋白免疫印迹、RT-PCR和细胞免疫荧光等技术检测TNF-α长期作用的WB-F344和LEPC细胞中DNA损伤、细胞有丝分裂检查点和中心体的标志物，探究染色体不稳定性的机制。
　　14.利用免疫组化分析技术，分别检测了163例肝癌组织中CK19和OV6的表达情况，统计分析CK19和OV6双阳性组和对照组的临床病理信息和患者预后资料，研究CK19和OV6双阳性患者的病理特征和预后关系。
　　15.利用蛋白免疫印迹的方法检测TNF-α长期作用的WB和LEPC细胞中加入索拉菲尼后STAT3磷酸化水平，探究索拉菲尼抑制TNF-α长期作用的WB和LEPC细胞生长的机制。
　　16.利用细胞成球实验和流式细胞检测技术，检测TNF-α长期作用的WB和LEPC细胞加入索拉菲尼后的成球数目和细胞凋亡比例，探究索拉菲尼对TNF-α长期作用的WB和LEPC细胞功能的影响。
　　17.利用免疫组化分析技术检测203例肝癌术后服用索拉菲尼和77例术后未服用索拉菲尼的肝癌患者组织中CK19和OV6的表达情况，统计分析各组肝癌患者预后资料，评估索拉菲尼对CK19和OV6双阳性肝癌患者的治疗效果。
　　研究结果:
　　1.在肝癌患者疾病进展过程中，随着病情的进展LPC不断扩增，其中肝硬化阶段LPC明显扩增。
　　2.利用大鼠DEN诱癌模型模拟人的肝癌发生，研究发现大鼠诱癌过程中LPC不断扩增，其中肝硬化阶段LPC明显扩增。
　　3.为了研究肝巨噬细胞对LPC扩增的影响，我们发现DEN大鼠诱癌过程中，在肝硬化阶段巨噬细胞明显浸润，炎症因子分泌增多，说明巨噬细胞可能促进了LPC的扩增。
　　4.我们通过实验发现，在DEN诱癌模型的肝硬化阶段，由慢性炎症刺激扩增的LPC在NOD/SCID的小鼠皮下可以成瘤，说明这个阶段的LPC可能已经向肝癌干细胞发生转化。
　　5.为了进一步验证巨噬细胞在LPC向肝癌干细胞转化过程中的作用，我们建立了GdCl3清除肝脏巨噬细胞的大鼠模型，我们发现巨噬细胞清除组，CK19和OV6双阳性的肝癌发生受到抑制。
　　6.我们利用肝巨噬细胞分泌主要炎症因子TNF-α和IL-6分别刺激大鼠肝前体细胞系WB-F344，20w后将其种在NOD/SCID小鼠皮下，发现TNF-α长期刺激的LPC在皮下可以成瘤，这说明了TNF-α可能促进LPC发生转化。
　　7.为了探究TNF-α长期作用的LPC是否具有肝癌干细胞的特征，我们检测了肝癌干细胞标志物CD90和EpCAM，发现长期刺激组的标志物表达都明显升高，说明TNF-α长期作用的LPC获得了肝癌干细胞特征。
　　8.为了探究LPC向肝癌干细胞转化的具体机制，我们对TNF-α长期作用的WB和LEPC细胞系做了染色体核型分析，发现TNF-α刺激可以导致LPC染色体数目发生改变。
　　9.前期的结果部分说明了CK19和OV6双阳性的肝癌可能是LPC来源的，我们的临床分析发现这部分的肝癌患者预后更差。
　　10.我们发现索拉菲尼可以通过抑制STAT3磷酸化抑制LPC来源的肝癌干细胞生长。
　　11.临床分析研究发现CK19和OV6双阳性的肝癌患者可能对索拉菲尼治疗更敏感。
　　结论:
　　本课题主要是研究肝脏在慢性炎症环境下，LPC可以明显扩增，扩增的LPC在炎症因子的刺激下可以部分转变成为肝癌干细胞。我们通过研究发现，CK19和OV6双阳性的肝癌可以部分认为是LPC恶性转化而来的肿瘤，临床分析结果提示CK19和OV6双阳性的肝癌患者预后更差，并且对索拉菲尼治疗更为敏感。上述的研究结果可能对索拉菲尼在肝癌的临床治疗中有指导价值。

目录

声明

摘要

英文缩略表格

前言

一、材料

二、实验方法

实验结果

一、人体肝癌发生过程中肝硬化阶段LPC扩增明显

二、大鼠DEN诱癌过程中肝硬化阶段LPC扩增明显

三、大鼠DEN诱癌过程中肝硬化阶段巨噬细胞明显浸润

四、慢性炎症刺激LPC向肝癌干细胞恶性转变

五、GdCl3清除肝脏巨噬细胞抑制CK19+0V6+肝癌的发生

六、TNF-α促进肝前体细胞系发生恶性转化

七、TNF-α剌激肝前体细胞系获得肝癌干细胞特征

八、TNF-α刺激导致肝前体细胞系发生染色体不稳定性

九、CK19+OV6+的肝癌患者预后更差

十、索拉菲尼抑制TNF-α长期刺激的肝前体细胞系生长

十一、CK19+OV6+的原发性肝癌患者对索拉菲尼治疗更敏感

讨论

参考文献

文献综述 肝癌治疗的研究进展

成果和发表论文

致谢