肉毒素A在子宫内膜异位症模型小鼠疼痛中的作用及机制研究

摘要

目的： 子宫内膜异位症（endometriosis,EMs）是一种临床常见慢性妇科疾病，该疾病是由有活性的内膜细胞种植在子宫内膜意外位置形成的，育龄女性的发病率约10%。目前治疗该疾病的主要方法是手术切除子宫内膜异位病灶和药物治疗，但术后容易复发和难于耐受的药物不良反应，使得至今临床上尚无有效治疗方法及药物。子宫内膜异位症所致疼痛属于内脏痛的范畴，神经炎症反应是启动和维持这类慢性妇科疼痛的重要原因。在疼痛发生发展过程中，激活的神经胶质细胞对慢性疼痛的整合和传导起到重要作用。研究发现脊髓小胶质细胞在功能性慢性内脏痛中发挥启动作用。小胶质细胞受体如P2X家族、P2Y家族、CXCL家族、CXCR家族等被激活活化后，分泌的IL-1β、IL-6、TNF-α和PGE2可以使神经元去极化兴奋性增高，产生中枢敏化，而中枢敏化后神经元又会产生大量的ATP、SP(Substance P)和谷氨酸等继续激活小胶质细胞，造成痛觉敏化。值得注意的是磷脂酰肌醇3-激酶/丝氨酸、苏氨酸激酶（PI3K/Akt）信号通路在神经病理性疼痛和炎性疼痛模型中表达增加，该通路可以通过激活下游信号通路，导致小胶质细胞的活化，而阻断该通路可以缓解由神经损伤和炎症引起的机械痛。 肉毒素A（botulinum toxin type A,BoNT-A）是肉毒杆菌产生的一种外毒素。BoNT-A与突触前神经末梢结合，通过胞饮作用进入细胞，与其中的相关蛋白结合，抑制突触小泡中乙酰胆碱的释放，阻断神经肌肉接头信号传递。动物模型研究表明BoNT-A能够抑制疼痛介质的释放，从而降低因疼痛介质产生的炎症反应。在体内，BoNT-A已被证明能够减少受损的膀胱组织中疼痛介质的释放，如缓激肽、P物质，并能抑制背根神经节中降钙素基因相关肽（CGRP）和谷氨酸的分泌从而抑制中枢敏化。此外，在有害刺激条件下或周围神经损伤中，BoNT-A可抑制多种神经递质，如谷氨酸和P物质的分泌和释放，下调伤害发生后背根神经节中早期蛋白的表达，从而阻断外周和中枢痛觉敏化。目前BoNT-A已用于临床病理性疼痛的治疗，如偏头痛、肌肉骨骼性疼痛、难治性三叉神经痛等且取得了较满意的疗效。基于BoNT-A在抑制神经病理性疼痛上发挥了重要作用，我们猜测BoNT-A是否在抑制子宫内异症疼痛中发挥作用，但有关BoNT-A应用于子宫内异症疼痛的研究尚未见报道。 为了进一步研究BoNT-A在抑制小胶质细胞活化，缓解子宫内膜异位症疼痛上的作用和机制，我们应用以下实验技术和方法分别在BV-2小胶质细胞细胞系和子宫内膜异位症小鼠模型中进行体外和体内研究。 方法： 一、观察BoNT-A对LPS诱导BV-2细胞形态变化的影响 小鼠小胶质细胞BV-2系培养于DMEM+10%FBS+1%Gln+1%P/S培养基中放置于37℃、5%CO2恒温培养箱，待细胞生长密度达到80%左右，按照1：3的传代比将细胞铺入100mm培养板中。细胞贴壁24h，弃去培养基，用PBS清洗一遍，去除少量的死细胞，培养基中加入LPS或BoNT-A，设置空白对照组、LPS组、BoNT-A组和LPS+BoNT-A组，作用24h后从培养箱取出细胞孔板，在显微镜下观察细胞形态，对比正常组细胞，观察形态变化。 二、研究BoNT-A对LPS诱导BV-2细胞中炎症因子的释放和蛋白表达变化的影响 小鼠小胶质细胞设置对照组、LPS组、BoNT-A组和LPS+BoNT-A组，作用24h后，Confocal观察细胞中Iba1和OX42蛋白表达的变化；ELISA检测各组细胞上清中IL-1β、TNF-α、IL-6和PGE2炎症因子的表达；qPCR检测各组细胞中P2X7、CX3CR1、Akt、P38MAPK和JNK基因的mRNA水平，Western Blot检测各组细胞中P2X7、CX3CR1、Akt、P38MAPK、JNK、p-Akt、p-P38MAPK、p-JNK蛋白的表达变化，实验至少重复3次。 三、子宫内膜异位症（EMs）小鼠模型的建立 55只4周龄（15-16g左右）雌性BALB/c小鼠，适应性饲养3周，小鼠体重达20-22g左右。建模前一周，挑选较健壮小鼠15只，进行雌激素（苯甲酸雌二醇）注射，注射剂量为100ug/kg，注射2次。一周后取出雌激素注射小鼠的子宫，剔除周围组织后将子宫放入有生理盐水的无菌皿中。用精细剪将子宫剪成肉糜直至26号注射器针头可以吸入打出。剪碎后在肉糜中加入无菌的生理盐水，按一只供体动物的子宫肉糜注射两只受体动物，200μl/只受体的量进行腹腔注射。1周后模型鼠腹腔注射20IU·kg-1的缩宫素，可观察到明显的扭体反应即确认小鼠子宫内膜异位症模型建立成功，并在处死小鼠后开腹确认异位灶存在。同时设置假手术对照组，即以同体积无菌生理盐水腹腔注射小鼠。 四、观察BoNT-A对EMs模型小鼠扭体反应的作用 EMs模型建立后，在给药前和给药1、3、5、7天后，各组小鼠腹腔注射缩宫素20IU/只后，观察小鼠30min内出现扭体反应次数，记录数据，分析药物对模型小鼠扭体反应的影响。 五、观察BoNT-A对EMs模型小鼠活化小胶质细胞的影响 建立EMs动物模型，给药7天后，麻醉解剖动物取出脊髓腰膨大（L4～L5），制备脊髓组织切片，免疫荧光检测各组小鼠脊髓背角中Iba1和OX42蛋白的表达；免疫组化检测P2X7、CX3CR1蛋白的表达。然后，分别提取各组小鼠脊髓组织的RNA样本和蛋白样本，qPCR、Western Blot检测各组小鼠脊髓组织中P2X7、CX3CR1、Akt、JNK、P38MAPK及p-Akt、p-JNK、p-P38MAPK的表达。 结果： 一、LPS诱导BV-2细胞形态学的改变 LPS刺激后细胞形态从圆形逐渐变为梭形，细胞触角增多。选择形态变化明显、浓度最低的处理组1ug/ml作为最适的LPS浓度用于后续实验。 二、LPS诱导BV-2小胶质细胞特异蛋白的表达和炎症因子释放 对照组、LPS组、BoNT-A组和LPS+BoNT-A组作用24h后，Confocal观察到LPS刺激后，细胞中Iba1和OX42蛋白明显升高；ELISA检测各组细胞上清中细胞分泌的IL-1β、TNF-α、IL-6和PGE2明显增加。 三、BoNT-A下调LPS诱导BV-2细胞的活化，抑制炎症因子的释放 BoNT-A干预后使Iba1和OX42蛋白表达下降，IL-1β、TNF-α、IL-6和PGE2炎症因子分泌下降。qPCR和Western Blot检测结果显示：LPS组的p-JNK表达水平明显升高，BoNT-A干预能明显下调LPS引起的p-JNK高表达。 四、BoNT-A抑制EMs模型小鼠中小胶质细胞活化状态 EMs模型建立后，在给药前和给药1、3、5、7天后，各组小鼠腹腔注射缩宫素20IU·kg-1后30min内，手术模型组扭体反应次数显著高于假手术组，BoNT-A干预后扭体反应次数显著降低。Confocal检测结果表明：手术模型小鼠脊髓背角Iba1和OX42蛋白表达高于假手术组，而BoNT-A干预后蛋白表达下降。Western Blot检测假手术组、手术对照组、0.5U/只BoNT-A组、1U/只BoNT-A组中P2X7、CX3CR1、Akt、JNK、P38MAPK及p-Akt、p-JNK、p-P38MAPK蛋白水平，结果显示：手术模型组各蛋白表达均明显上升，BoNT-A干预后蛋白表达下降，且随着BoNT-A浓度的增加，蛋白下降趋势更为明显。免疫组化结果显示：手术模型组P2X7、CX3CR1蛋白表达显著高于假手术组，BoNT-A干预后能显著降低P2X7、CX3CR1的蛋白表达水平。 五、BoNT-A通过抑制脊髓P2X7，CX3CR1，Akt的表达和P38MAPK，JNK的磷酸化缓解子宫内膜异位症疼痛 BoNT-A干预后，手术模型组小鼠扭体反应次数显著降低。Confocal检测结果表明：BoNT-A干预后Iba1和OX42蛋白表达显著下降。Western Blot检测结果表明：BoNT-A下调手术模型小鼠疼痛介导的P2X7/CX3CR1的蛋白表达，显著抑制脊髓Akt蛋白的表达和P38MAPK，JNK的磷酸化。免疫组化结果显示：BoNT-A干预后手术模型小鼠脊髓P2X7、CX3CR1的蛋白表达水平显著降低。 结论： BoNT-A体外水平能够抑制LPS诱导的BV-2小胶质细胞形态的变化以及炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α和PGE2的释放，但BoNT-A抑制LPS诱导BV-2细胞活化的具体分子机制并不完全清楚。在EMs模型小鼠体内BoNT-A能够明显降低内异症疼痛小鼠扭体反应的次数和频率，显著下调EMs模型小鼠疼痛介导的P2X7/CX3CR1的蛋白表达，抑制模型小鼠脊髓Akt蛋白的表达和P38MAPK，JNK磷酸化。BoNT-A可能通过抑制小胶质细胞的活化及其炎症因子的释放，下调脊髓小胶质细胞P2X7/CX3CR1的表达，抑制脊髓小胶质细胞Akt、P38MAPK蛋白表达及其磷酸化对子宫内膜异位症疼痛发挥作用。除此之外，BoNT-A还可能通过抑制星形胶质细胞的活化，抑制JNK信号发挥镇痛作用。所以BoNT-A对子宫内膜异位症疼痛的治疗可能具有潜在的临床应用价值，值得进一步深入研究。

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