KATP在高糖诱导的肾系膜细胞增殖和基质蛋白合成中的作用

摘要

随着糖尿病的日益流行，糖尿病肾病发病率不断增加，糖尿病已经成为终末期肾病的主要病因之一。因此关于糖尿病肾病的发病机制的探讨也在不断深入，血流动力学改变、代谢通路的改变、炎症/氧化应激、其他（自噬等）是目前公认的糖尿病肾病的发病机制，但是现有的发病机制的探讨并没有改善糖尿病肾病发病率不断增加的现状，因此可能有其他尚未引起重视的机制存在。 研究表明ATP敏感性钾通道(ATP-sensitive potassium channels,KATP)是一类对细胞内外ATP敏感的由异源性多聚体组成的钾通道，表达于包括心肌、胰岛、肾脏、神经元等全身多种组织和细胞，主要是介导细胞代谢状态和膜的兴奋度，参与多种重要的生物学过程。KATP可以调控胰岛素和胰高血糖素等的分泌，KATP通道功能障碍在糖尿病的发生中起着至关重要的作用，但KATP在糖尿病并发症中的作用则鲜见报道。研究表明在慢性肾脏疾病（Chronic kidney disease,CKD）中，KATP通道开放剂可通过减少炎症细胞浸润、减轻氧化应激等方式保护肾脏避免进一步损伤。而应用KATP通道开放剂尼可地尔则对eNOS缺陷糖尿病大鼠肾脏病理改变有改善作用，且临床数据显示早期糖尿病肾病患者应用KATP通道开放剂尼可地尔肾功能及尿白蛋白水平均有显著改善。提示KATP功能障碍可能在糖尿病肾病发病中起着重要作用。 KATP通道是介导细胞能量状态和细胞兴奋性的重要介质，AMP激活的蛋白激酶(AMP activatedprotein kinase,AMPK)是细胞能量代谢通路重要的组件。越来越多的证据表明AMPK的活化抑制糖尿病肾病的发生发展。既往的研究报道AMPK的激活剂或172位苏氨酸的磷酸化的增加活化能够提高胰岛β细胞、心室肌细胞等多种细胞中KATP通道的活性，且免疫共沉淀和质谱分析表明AMPK的α亚基和KATP通道亚基相结合。提示AMPK可能是KATP通道活性的重要调控因子，在糖尿病肾病的发病过程中起着重要的作用。 鉴于以上AMPK和KATP通道活性的调控在糖尿病肾病的发生发展中可能起到重要的作用，提出假设：糖尿病环境下，肾细胞中AMPK的表达受到抑制，从而降低KATP通道的活性，诱发一系列病理反应，促进糖尿病肾病的发生和发展。 研究目的： 系膜细胞外基质分泌增多和系膜细胞的过度增殖是糖尿病肾病早期的主要病理学特征之一。以肾小球系膜细胞（Glomerular mesangial cells，GMC）为研究对象，首先证实KATP通道在肾系膜细胞中的存在和定位，确定合适的葡萄糖处理浓度和时间。其次，通过高浓度葡萄糖处理系膜细胞，使用KATP通道开放剂，确定KATP通道的活性对高浓度葡萄糖处理的肾系膜细胞的增殖和基质蛋白的表达等的影响。最后通过对AMPK的激活，证实KATP通道的作用是否受AMPK所调控。 研究方法： 1.从SD大鼠肾小球分离系膜细胞进行原代培养，通过Realtime-PCR测定KATP的各亚基(Kir6.1、Kir6.2、SUR1、SUR2A和SUR2B)的mRNA的表达，通过荧光双染结合confocal显微镜观察KATP通道在系膜细胞上的分布和定位。将系膜细胞分别加入0mmol/L、10mmol/L、20mmol/L、30mmol/L、40mmol/L葡萄糖培养12、24小时（h），观察细胞增殖(CCK-8法)，凋亡(Annexin V-FITC/PI法)，细胞周期变化(碘化丙啶Propidium PI染色，随后做细胞流式分析)，测定基质蛋白纤维粘连蛋白（fibronectin，FN）的含量(ELISA分析法)，以建立高糖诱导的肾小球系膜细胞增殖模型。 2.（1）在大鼠肾小球系膜细胞中，加入或不加入30mmol/L葡萄糖处理，分为高糖组和空白对照组，培养24h后，观察细胞的增殖，测定基质蛋白FN和IV型胶原（type IV collagen,IV-C）的含量(ELISA分析法)，通过Western-blot法测定pAMPK/AMPK，分析AMPK的表达和活性，全细胞电流记录法测定KATP通道的活性，Realtime-PCR法测定其各亚基(Kir6.1、Kir6.2、SUR1、SUR2A和SUR2B)的mRNA的表达。（2）大鼠肾小球系膜细胞高糖处理后分为葡萄糖处理组（葡萄糖组）、葡萄糖+溶剂组(KATP通道开放剂的溶剂DMSO)（葡萄糖+DMSO组）、KATP开放剂diazoxide(DZX)+葡萄糖培养组（DZX+葡萄糖组）和DZX+KATP阻断剂5-羟基癸酸(5-HD)+葡萄糖培养组（DZX+5-HD+葡萄糖组）。培养24h后收集细胞，检测细胞的增殖，细胞中基质蛋白FN、IV-C含量，KATP的活性及其各亚基的mRNA的表达。 3.大鼠肾小球系膜细胞高糖处理后分为葡萄糖处理组（葡萄糖组）、葡萄糖+溶剂组(AMPK激活剂的溶剂DMSO)（葡萄糖+DMSO组）、AMPK激活剂5-amino-4-imidazolecarboxamide riboside(AICAR)+葡萄糖培养组（AICAR+葡萄糖组）。培养24h后收集细胞，测定各组AMPK的表达和活性，以及KATP的活性测定。 研究结果： 1.荧光双染显示KATP通道在肾小球细胞膜和线粒体膜上均有表达，Realtime-PCR结果显示在肾小球系膜细胞上KATP通道亚基主要以Kir6.1/SUR2A和/或Kir6.1/SUR2B形式存在。葡萄糖梯度培养显示30mmol/L葡萄糖培养24小时增殖率较0、10、20mmol/L葡萄糖培养组显著增高（p<0.01），凋亡率较20mmol/L葡萄糖组无显著差异，细胞周期G1期细胞较0mmol/L组显著减少（p<0.01），基质蛋白FN在30mmol/L24小时组含量最高（p<0.01）。 2.（1）高糖培养后系膜细胞增殖显著（p<0.01），基质蛋白FN、IV-C水平显著增高（p<0.01），KATP的活性及其Kir6.1、SUR2A、SUR2B亚基的mRNA的表达下降（p<0.01），pAMPK/AMPK下降（p<0.01）。（2）DZX+葡萄糖组与葡萄糖组和葡萄糖+DMSO组相比，细胞增殖显著下降（p<0.01），基质蛋白FN、IV-C含量显著降低（p<0.01），KATP的活性显著增高（p<0.05），Kir6.1表达无显著差异，SUR2A/SUR2B显著下降（p<0.01）。DZX+5-HD+葡萄糖组与DZX+葡萄糖组相比细胞增殖显著升高（p<0.01），基质蛋白FN、IV-C含量显著升高（p<0.01），KATP的活性下降（p<0.05），SUR2A/SUR2B表达较DZX+葡萄糖组显著增高（p<0.01，p<0.05）。 3.AICAR+葡萄糖组与葡萄糖组和葡萄糖+DMSO组相比，pAMPK/AMPK显著升高（p<0.01），KATP的活性显著增高（p<0.01）。 研究结论： KATP通道主要以Kir6.1/SUR2A和/或Kir6.1/SUR2B形式在肾小球系膜细胞膜和线粒体膜上表达，30mmol/L高糖诱导下肾小球系膜细胞增殖明显，基质蛋白合成增加，KATP的活性及其各亚基的mRNA的表达下降，AMPK的活性下降。加入DZX后KATP的活性明显提高，细胞增殖显著下降，基质蛋白FN、IV-C显著降低，5-HD可以逆转上述效应，提示KATP开放剂可以改善高糖诱导的肾小球系膜细胞增殖和基质蛋白合成增加。AMPK的激活剂可以提高KATP通道的活性，提示AMPK可能对KATP通道在肾小球系膜细胞中起到的是正调控的作用。KATP通道可能在糖尿病肾病发生发展过程中起着重要作用，AMPK与KATP存在调控关系。

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