MicroRNA-181a调控na(i)ve CD4+T细胞活化及其在类风湿关节炎发病中作用

摘要

类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis，RA)是一种病因未明的慢性全身性自身免疫性疾病，以侵蚀性关节炎为特征，最终导致关节畸形而致残。全球大约有1％的人群受类风湿关节炎疾病的困扰，其中女性发病率远高于男性。尽管各类固有免疫和适应性免疫细胞共同参与类风湿关节炎的致病机制，但是从人类和动物的各项研究中可以发现CD4+T细胞是RA治病机制的核心部分。
　　表观遗传学是调节细胞生理机制的一个新的研究领域。microRNAs（miRNAs）作为一种表观遗传的修饰，参与了细胞增殖、凋亡、分化，能量代谢及免疫调节等一系列重要的生理及病理过程，在多种疾病的发病机制中扮演重要角色。miRNAs是一类内源性，长21-25个核苷酸序列的非编码RNA，能够引发mRNA裂解和抑制其转录翻译，从而进行转录后调控。
　　miR-181a是一类调控T细胞敏感性的关键分子。miR-181a通过T细胞的抗原受体可以影响成熟T细胞的活化阈值。Goronzy教授通过研究发现，年龄是影响miR-181a表达的一个重要因素，随着年龄的增加，miR-181a的表达减少，使得TCR信号受刺激后，影响初始的ERK信号传导，抑制T细胞活化。最近一项体外实验表明miR-181a是调节炎症反应的关键因子，在炎症刺激下表达明显增多。在类风湿关节炎患者的各类细胞中都有异常表达的miRNAs，可参与调控类风湿关节炎致病机制的特定通路。然而miR-181a在类风湿关节炎中的表达趋势以及在疾病中的作用机制仍不清楚。
　　本课题首先评估类风湿关节炎患者外周血CD4+T细胞及其亚群的T细胞过度活化的表型;然后，进一步鉴定调控T细胞过度活化的miRNA与其靶基因的作用机制;最后通过体外实验研究miR-181a调控T细胞活化的治病机制。这些研究可以揭示类风湿关节炎T细胞过度活化的新的分子机制，为寻求治疗类风湿关节炎提供思路。
　　第一章 类风湿关节炎患者外周血中CD4+T细胞及其亚群的功能研究
　　目的:
　　研究类风湿关节炎患者CD4+T细胞及其亚群的活化功能。
　　方法:
　　1.密度梯度离心法分离33例RA和28例健康对照的外周血单个核细胞，MACS磁珠分选出CD4+T细胞。
　　2.流式细胞术检测钙内流情况。
　　3.表面染色检测表面活化标志物CD25和D69的表达。
　　4.BD Phosflow检测LCK、ZAP70和ERK蛋白磷酸化水平。
　　结果:
　　1.同健康对照组相比，RA患者的CD4+T细胞和na(i)ve CD4+T细胞中均观察到明显升高的钙离子内流，分别P＜0.001，P＜0.01;同时发现钙离子内流的水平与疾病活动度密切相关，但与年龄无关;在记忆性CD4+T细胞中两组之间钙流水平无统计学差异。
　　2.RA患者的CD4+T细胞及其亚群的CD25和CD69的表达均明显高于健康对照组。
　　3.RA患者的CD4+T细胞和na(i)ve CD4+T细胞的LCK、ZAP70和ERK蛋白磷酸化水平均高于健康对照组;在记忆性CD4+T细胞中，除了LCK，ZAP70和ERK的表达无统计学差异。
　　结论:
　　类风湿关节炎患者外周血CD4+T细胞的钙离子内流水平明显升高，与疾病活动度紧密相关。CD4+T细胞的TCR信号通路处于过度活化状态，如CD25和CD69的高表达，ERK、ZAP70、LCK磷酸化水平的增高。同时类风湿关节炎患者na(i)ve CD4+T细胞具有很强的钙离子信号和ZAP70、ERK的磷酸化水平明显增高，而在记忆性CD4+T细胞中未出现明显的差异表达，说明na(i)ve CD4+T细胞在T细胞活化中起到更为重要作用，所以在接下来的实验中将na(i)ve CD4+T细胞作为研究对象。
　　第二章 类风湿关节炎患者na(i)ve CD4+T细胞miR-181a表达及其下游调控关系的建立
　　目的:
　　分析调控类风湿关节炎患者na(i)ve CD4+T细胞过度活化的miRNA表达，确定miR-181a/DUSP6调控关系的建立。
　　方法:
　　1.密度梯度离心法分离18例RA和18例健康对照外周血单个核细胞，MACS磁珠分选出na(i)ve CD4+T细胞。
　　2.提取na(i)ve CD4+T细胞中的总RNA和总蛋白。
　　3.Real-time PCR检测miR-181a表达及DUSP6和PTPN22mRNA表达水平。
　　4.Western Blot检测DUSP6蛋白表达水平。
　　5.miR-181a mimic和inhibitor及其相应的阴性对照转染类风湿关节炎患者na(i)ve CD4+T细胞48h后，通过Real-time PCR和Western Blot验证DUSP6mRNA和蛋白水平的表达。
　　6.双荧光素酶报告基因验证DUSP6是miR-181a的靶基因。
　　结果:
　　1.根据Targetscan数据库，初步考虑miR-181a是非常适合研究且可行性很高的调控DUSP6和PTPN22表达，进而控制T细胞活化通路的miRNA。
　　2.与健康对照组相比，类风湿关节炎患者na(i)ve CD4+T细胞miR-181a表达明显多于对照组，P＜0.001;与疾病活动度呈正相关，r=0.59，P＜0.01。
　　3.类风湿关节炎患者na(i)ve CD4+T细胞DUSP6的mRNA表达水平明显降低，P＜0.05，但是PTPN22mRNA表达水平在疾病组和对照组间无明显差异。WesternBlot也表明类风湿关节炎患者na(i)ve CD4+T细胞DUSP6蛋白表达也明显少于健康对照组，P＜0.05。
　　4.与转染miR-181a mimic阴性对照相比，过表达miR-181a能降低DUSP6基因表达，但统计学无差异;显著下调蛋白表达，P＜0.001;同转染miR-181a inhibitor阴性对照相比，抑制miR-181a表达使DUSP6mRNA和蛋白水平表达均增多，P＜0.01。
　　5.通过构建DUSP6的3'UTR荧光素酶报告载体发现，与对照相比，共转miR-181a mimic及含DUSP6的3'UTR荧光素酶报告载体的细胞中荧光素酶的活动显著下降，将结合位点突变后，荧光素酶活性提高，提示miR-181a通过直接结合DUSP6的3'UTR发挥作用。
　　结论:
　　miR-181a的高表达促进类风湿关节炎疾病的发生发展和miR-181a对DUSP6表达的抑制导致的TCR信号通路过度活化密不可分，说明miR-181a/DUSP6调控关系在类风湿关节炎的发病机制中起到重要作用。
　　第三章 miR-181a/DUSP6调控关系对类风湿关节炎na(i)ve CD4+T细胞功能的影响
　　目的:
　　探索miR-181a/DUSP6调控关系对类风湿关节炎na(i)ve CD4+T细胞功能的影响。
　　方法:
　　1.密度梯度离心法分离12例活动性RA和12例健康对照的外周血单个核细胞，MACS磁珠分选出na(i)ve CD4+T细胞。
　　2.miR-181a inhibitor或阴性对照转染至类风湿关节炎患者na(i)ve CD4+T细胞。
　　3.Real-time PCR检测miR-181a表达，检测转染效率。
　　4.流式细胞仪检测钙离子内流水平。
　　5.流式细胞仪检测细胞因子分泌情况。
　　6.流式细胞仪检测na(i)ve CD4+T细胞分化。
　　结果:
　　1.类风湿关节炎患者na(i)ve CD4+T细胞转染miR-181a inhibitor和阴性对照，48小时后收细胞，提取细胞总RNA，进行RT-PCR，评估转染效率，结果发现miR-181a表达下降，转染成功，进行下面实验。
　　2.与转染miR-181a inhibitor阴性对照相比，抑制miR-181a表达能明显减少钙离子内流。
　　3.同健康对照组相比，类风湿关节炎患者na(i)ve CD4+T细胞中IL1α，IL6，TNF-α和IFN-γ表达明显高于健康对照组，分别P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01，P＜0.05。但在IL-2和IL-10的表达上，两组之间均无明显统计学差异。同转染miR-181a inhibitor阴性对照相比，下调miR-181a表达能明显减少IL1α，IL6和TNF-α的表达，分别P＜0.01，P＜0.05，P＜0.01，对IFN-γ的表达无明显影响。
　　4.与转染miR-181a inhibitor阴性对照相比，抑制miR-181a表达能阻止类风湿关节炎患者na(i)ve CD4+T细胞向Th1细胞分化，P＜0.01，促进了向Th2细胞分化，但无统计学差异。
　　结论:
　　在类风湿关节炎na(i)ve CD4+T细胞中，抑制miR-181a表达导致DUSP6的表达上调，从而抑制ERK信号通路，进而使钙离子内流减少，影响T细胞活化，促炎因子分泌减少，抑制自身免疫反应。这些研究揭示了类风湿关节炎T细胞过度活化的新的分子机制，为寻求治疗类风湿关节炎提供思路。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

第一章 类风湿关节炎患者外周血中CD4+T细胞及其亚群的功能研究

一、材料

二、实验方法和步骤

三、统计与分析

四、实验结果

讨论

第二章 类风湿关节炎患者na(i)ve CD4+T细胞miR-181a表达及其下游调控关系的建立

一、材料

二、实验方法和步骤

三、统计与分析

四、实验结果

讨论

第三章 miR-181a／DUSP6调控关系对类风湿关节炎naive CD4+T细胞功能的影响

一、材料

二、实验步骤和方法

三、统计与分析

四、实验结果

讨论

结论

参考文献

综述 MicroRNAs在类风湿关节炎中的作用及应用进展

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致谢