高糖高脂环境对骨髓和脐带间充质干细胞成骨分化功能的影响

摘要

目的:
　　模拟糖尿病患者的内环境，观察高糖高脂对人来源的骨髓间充质干细(BMSCs)和脐带间充质干细胞(HUMSCs)增殖活性和成骨能力的影响，以期为组织工程方法促进糖尿病患者骨折愈合所需种子细胞的选择提供理论依据。
　　方法:
　　采用密度梯度离心法分离培养骨髓间充质干细胞，骨髓间充质干细胞鉴定采用流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞的表面抗原CD29、CD90和CD34、CD45的表达。高糖高脂环境对BMSCs和HUMSCs增殖能力的影响采用CCK-8细胞活性检测法。实验共分4组，收集第5代的BMSCs和HUMSCs分别接种于4块96孔板，A组:接种BMSCs，低糖细胞完全培养基培养。B组:接种BMSCs，高糖高脂完全培养基培养。C组:接种HUMSCs，低糖细胞完全培养基培养。D组:接种HUMSCs，高糖高脂完全培养基培养。每组设35个复孔，每天随机抽取5个复孔，连续测试7天。高糖高脂对BMSCs和HUMSCs的成骨分化能力的影响。实验共分4组。A组:BMSCs空白对照组采用传统的成骨诱导培养基。B组:高糖高脂成骨诱导培养基作为BMSCs实验组。C组:HUMSCs空白对照组采用传统的成骨诱导培养基。D组:HUMSCs实验组采用高糖高脂成骨诱导培养基。(1)观察4组细胞成骨诱导前和成骨诱导3天，14天时的形态。(2)成骨诱导7天，应用碱性磷酸酶染色试剂盒对4组细胞进行染色。(3)成骨诱导21天，应用茜素红对4组细胞进行染色。(4)成骨诱导15天，应用DBA染色试剂盒对4组细胞进行Ⅰ型胶原蛋白染色。(5)应用细胞碱性磷酸酶(ALP)活性比色法定量检测试剂盒，于成骨诱导第7、10、15天对4组细胞进行ALP的定量检测。(6)成骨诱导21天，应用RT-RPC法对比各组骨钙素基因的表达。
　　结果:
　　一:BMSCs和HUMSCs细胞形态及分子标志表达。(1)接种24小时后细胞贴壁，3天后多见梭形和多角形细胞，9天后长梭形细胞增多，相邻集落融合。所观察的细胞形态符合间充质干细胞特征。(2)流式细胞仪检测，本实验分离的骨髓间充质干细胞表面表达CD29(99.8％)、CD90(100％);低表达CD34(1.4％)和CD45(0.2％)，符合间充质干细胞的表面抗原特征。
　　二:培养环境对BMSCs和HUMSCs增殖能力的影响。C组细胞增殖最快，B、D两组较慢，平台期A、C两组差值无统计学意义(P＞0.05),A、C和B、D两组的差值具有统计学意义(P＜0.05)。B、D两组的细胞形态明显发生改变，细胞收缩，排列无序。
　　三:高脂高糖对BMSCs和HUMSCs诱导成骨分化的影响(1)4组细胞的ALP染色均呈阳性，但B、D两组阳性较弱。(2)4组细胞茜素红染色均呈阳性，但B、D两组钙结节数量较少，形态较小。(3)4组细胞的Ⅰ型胶原蛋白染色均呈阳性，但B、D两组所染的棕黄色较浅。(4)4组细胞的ALP活性表达趋势相同，均在成骨诱导第10天达到峰值，第15天明显回落。但B、D两组表达量较低，同A、C两组的差值具有统计学意义(P＜0.05)。(5)4组细胞均表达骨钙素基因，其中A、C两组无统计学差异(P＞0.05)，B、D两组表达量较低，同A、C两组的差值具有统计学意义。(P＜0.05)
　　结论:
　　1.常规培养条件下HUMSCs的增值速度比BMSCs更快。2.在高糖高脂环境下，BMSCs和HUMSCs的增殖活性均降低，但无差异。3.高糖高脂环境下，BMSCs和HUMSCc虽然成骨分化的活力受损，但仍具有成骨能力。4.高糖高脂环境下，HUMSCs和BMSCs的成骨能力未见显著区别。5.骨组织工程学领域，HUMSCs可以替代BMSCs作为种子细胞。

目录

摘要

符号说明

前言

材料与方法

1．实验材料

2．实验器材

3．实验方法

4．统计学处理

结果

1．骨髓间充质干细胞的分离及培养

2．骨髓间充质干细胞和脐带间充质干细胞的增殖能力检测结果及高糖高脂对其增殖能力的影响

3．骨髓间充质干细胞和脐带间充质干细胞的成骨分化能力及高糖高脂对其成骨能力的影响

讨论

一．骨髓间充质干细胞的提取

二．骨髓间充质干细胞和脐带间充质干细胞的生物特性

三．骨髓间充质干细胞和脐带间充干细胞的成骨分化

结论

附图

参考文献

综述 骨组织工程学种子细胞选择的研究进展

致谢

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