RGD序列肽修饰的蚕丝人工韧带在兔ACL重建中的实验研究

摘要

目的
　　将RGD多肽结合于丝素蛋白材料表面，实现对蚕丝韧带的改性，提高BMSC的粘附与铺展效率，并应用于实验动物的前交叉韧带重建实验，为组织工程化蚕丝人工韧带的进一步制备研究提供理论依据。
　　方法
　　取一周左右新西兰大白兔骨髓间充质干细胞，传代培养并行流式细胞仪及免疫荧光检测细胞种类。以EDC/NHS将丝素蛋白中的羧基活化，以PBS液配制的GRGDSPC对蚕丝韧带进行表面修饰。取6根RGD序列肽修饰的蚕丝韧带置于6孔板内作为实验组，同时取6根未经修饰的蚕丝韧带置于另一六孔板内作为对照组，取第三代BMSCs细胞悬液均匀滴加于蚕丝韧带上并置于细胞恒温培养箱中培养，4h和12h后，分别通过消化法收集细胞悬液通过细胞计数板计数。
　　取第四代骨髓间充质干细胞，人工蚕丝韧带复合7天，形成BMSC-蚕丝韧带复合材料。选取新西兰大白兔36只（均经检疫合格），将其随机分为三组（实验组、对照组和空白组），每组12只。实验组应用RGD序列肽修饰的复合材料，对照组为未经修饰的复合材料，空白组为单纯蚕丝韧带。各组均于无菌条件下重建右侧前交叉韧带。术后4W、8W、16W后取出移植物，分别行大体观察、组织学及生物力学检测。所得实验数据均通过SPSS13.0进行统计学分析。
　　结果
　　1、骨髓间充质干细胞的培养及鉴定
　　贴壁法分离并提纯BMSCs，置于倒置显微镜下观察，细胞贴壁生长，呈不规则梭形。免疫荧光检测，结果显示CD34阴性，CD44、CD50阳性，表现为干细胞特性。
　　2、人工蚕丝韧带对BMSCs的粘附率
　　消化法测定细胞粘附率，结果显示:4h时的粘附率实验组0.26±0.05，对照组0.12±0.03，P＜0.01;12h时的粘附率实验组0.46±0.04，对照组0.21±0.02，P＜0.01。经RGD肽修饰的蚕丝韧带粘附率明显高于未经修饰的蚕丝韧带，通过t检验分析，两组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。
　　3、移植物取材观察
　　术后4W，实验组关节腔内疏松结缔组织生长较为明显，韧带局部被滑膜所包裹，韧带两端在骨道内稳定，切片显示大量炎症细胞，以粒细胞及淋巴细胞为主，韧带本身可见少量弹性纤维在蚕丝束间出现。对照组关节腔内疏松结缔组织出现，不过韧带表面滑膜包绕不明显，切片见大批炎性细胞聚集，韧带未见显著性纤维长入。空白组韧带表面无滑膜包绕，切片可见炎性细胞浸润，韧带未见明显纤维长入。术后8W，实验组关节腔内滑膜明显增生并包绕韧带，关节内滑液清亮，部分致密结缔组织长入韧带，切片见炎症细胞明显减少，韧带纤维结构与蚕丝束结合紧密。对照组少量疏松结缔组织与韧带附着，外层滑膜包绕明显，切片见炎症细胞减少明显，蚕丝束表面被少量结缔组织包绕，未见血管结构生长。空白组韧带表面滑膜覆盖不明显，切片可见少量炎性细胞，未见明显纤维结构。术后16W，实验组韧带表面结缔组织生长明显，完全包绕韧带，表面可见微小血管生长，滑膜丰富，关节内滑液清亮，关节软骨完好无磨损，切片见蚕丝束与致密结缔组织紧密结合，纤维结缔组织已长入蚕丝韧带，微型血管出现。对照组韧带部分被软组织覆盖，滑膜生长旺盛，切片蚕丝束表面可见有纤维结构附着，未发现明显血管结构。空白组韧带表面大部分由滑膜覆盖，切片见少量结缔组织包绕蚕丝束。各组取材后均行力学检测，记录所得最大抗拉强度值，结果显示RGD肽修饰的蚕丝韧带复合体的抗拉强度明显高于未经修饰的蚕丝韧带复合体以及单纯蚕丝韧带，差别存在统计学意义（P＜0.05）。
　　结论
　　1、RGD肽与蚕丝韧带复合后可明显促进BMSCs的粘附与铺展效率。
　　2、RGD肽修饰的蚕丝人工韧带与BMSCs形成复合体，在膝关节微环境下能够加快移植物韧带化的趋势。
　　意义
　　近年来，韧带损伤病例呈现增多趋势，而相应重建手术随之增多。在重建材料的探索中，蚕丝被认为是一种有前途的重建材料，近年来研究发现，蚕丝丝素材料拥有良好的生物相容性，突出的力学性能，而且能够生物性降解，满足成为人工韧带材料的所有特性，可以作为骨科组织损伤修复的一类材料。而这种材料也存在细胞粘附不良的缺点。本实验中，通过在其表面共价接枝RGD肽，证明能提高BMSCs的粘附铺展效率。在兔膝关节微环境下，RGD肽修饰的蚕丝韧带表现出了比对照组和空白组明显的优势，为探索组织工程化蚕丝人工韧带的制备以及将来运用于临床提供理论及实验依据。

目录

摘要

符号说明

前言

材料与方法

实验材料

实验方法

结果

1．骨髓间充质干细胞的培养及鉴定

2．人工蚕丝韧带对BMSC的粘附率

3．移植物取材观察

讨论

一、蚕丝人工韧带的选择

二、BMSCs的应用

三、RGD肽对人工蚕丝韧带的表面修饰

四、ACL重建术中移植物的固定方法、术式的选择

五、移植物在膝关节微环境中的转化(与骨的愈合及腱的转化)

六、本课题的局限性及展望

结论

附图

参考文献

综述 RGD肽在骨科组织工程中的研究与应用进展

致谢

声明