CPDV的分离鉴定、PCR检测方法的建立及B2L基因同源性分析

摘要

该文由三部分构成,一是对采集的病料进行接触传染性脓疱皮炎病毒(CPDV)的分离和鉴定,为CPD的病原学诊断奠定基础.二是建立CPDV的PCR检测方法,加快了检测速度,提高了检测的特异性.三是采用PCR技术克隆出CPDV疫苗株(CPDVy),甘肃(CPDV1)、陕西(CPDV2)和山东(CPDV3)分离株的B2L基因,对其核苷酸序列的同源性进行比较及分析,绘制了系统进化树,以期了解CPDV疫苗株和流行株主要保护性抗原B2L基因的同源情况,为CPDV的防制提供分子流行病学资料.主要试验和结果如下:1.以采集的病羊痂皮为材料,采用原代犊牛睾丸细胞培养、磷钨酸负染、细胞超薄切片技术和动物接种试验,进行病毒的分离和鉴定.结果表明,所采集的17份痂皮中,有11份病料在犊牛睾丸细胞的连续8代以上培养中,出现规律的CPE;在用病料上清或细胞培养物进行磷钨酸负染的电镜检查中,可见到典型的副痘病毒粒子;细胞超薄切片中也可见到不同时期的病毒粒子形态;羔羊划痕接种后出现与自然病例完全相同的水泡和脓疱.这些结果均证明该试验中对病毒的分离鉴定是成功的.2.参照已发表的CPDV NZ-2株的基因序列,设计一对特异性引物,以CPDV疫苗株(CPDVy)细胞培养毒为模板,建立CPDV的PCR检测方法.结果表明,PCR对CPDV的检测与细胞培养中的CPE、电镜检测的结果相一致.对扩增产物进行序列分析,表明与NZ-2株的核苷酸同源性高达97%.用此方法对口蹄疫病毒、蓝舌病病毒和羊痘病毒进行扩增,结果均为阴性.此方法对17份病料的扩增结果与病毒的分离鉴定结果相一致.建立的PCR方法用于CPDV的检测是可行的、快速的、特异的.3.参照已发表的CPDV NZ-2株的B2L基因序列,利用PCR技术扩增出疫苗株、甘肃、陕西和山东的分离株B2L基因,将其分别克隆于pMD-18T载体并进行核苷酸序列测定,应用DNAStar软件对国内4株CPDV和NZ-2株序列进行同源性比较,并进行了进化树分析.结果表明,国内4株CPDV核苷酸序列与NZ-2株序列相比,国内的4株均在1111处有一碱基缺失;疫苗株CPDVy与甘肃的CPDV1株、陕西的CPDV2株和山东的CPDV3株的核苷酸同源性分别为99.7%,96.9%和97.4%,与NZ-2株的同源性为96.7%;国内CPDV株与NZ-2株的氨基酸序列同源性为92.0%~96.0%,此结果说明流行毒株和疫苗株B2L基因较保守,变异幅度较小,抗原变化不显著.在国内首次建立了CPDV的PCR检测方法,首次报道了国内分离株及疫苗株B2L基因核苷酸序列,并对其进行了同源性分析.

目录

文摘

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文献综述

第一章接触传染性脓疱皮炎及接触传染性脓疱皮炎病毒的研究现状

1.1接触传染性脓疱皮炎概况

1.2 CPDV的病原学特性及研究进展

1.3流行病学特征

1.4发病机制及临床症状

1.5病理变化

1.6诊断方法研究

1.7免疫特性研究进展

1.8 CPDV防制策略

1.9结语

试验研究

第二章接触传染性脓疱皮炎病毒的分离和鉴定

2.1材料

2.2方法

2.3结果

2.4讨论

2.5小结

第三章接触传染性脓疱皮炎病毒PCR检测方法的建立

3.1材料

3.2方法

3.3结果

3.4讨论

3.5小结

第四章接触传染性脓疱皮炎病毒B2L基因的克隆和同源性分析

4.1材料

4.2方法

4.3结果

4.4讨论

4.5小结

结论

致谢

参考文献

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