百合无症病毒的RT-PCR和核酸杂交检测及其外壳蛋白在大肠杆菌中的表达

摘要

百合无症病毒是危害百合的重要病毒，在世界各地均有分布，是我国禁止进境的潜在危险性有害植物病毒。该病毒病的发生日益严重，给百合种植业造成极大的经济损失。目前我国植物病毒检验检疫工作和脱毒检测的大量应用还是在血清学检测上，特别是ELISA检测。但百合无症病毒难以提纯作为抗原，抗血清的生产没有完全达到商品化，检测基本依赖外国进口试剂盒。分子生物学检测方法灵敏度高，有很高的实际应用价值。为此，本研究开展百合无症病毒的分子生物学检测方法及外壳蛋白原核表达的研究，为其检验检疫提供方法标准，并为抗血清的制备提供蛋白融合表达抗原材料。 对百合病株检测表明，直接法，间接法，双抗夹心法，斑点酶联四种血清学检测限度依次为：灵敏度320μg，160μg，80μg，160μg病叶。植株脱毒苗的检出率分别为30﹪，35﹪，45﹪，55﹪。根据百合无症病毒核酸序列设计一对特异性引物，对提取百合叶片中总RNA进行反转录扩增，得到412bp的目的片段，建立百合无症病毒的RT-PCR检测方法。将此片段克隆到pUCm-T载体上，酶切后回收目的片段。用随机引物法地高辛标记合成cDNA探针，进行核酸斑点杂交检测。RT-PCR和核酸杂交检测百合病叶总RNA的稀释限度分别为1：10-6和1：10-2。检测方法快速，灵敏。 应用RT-PCR方法从感病百合总RNA中扩增出百合无症病毒的外壳蛋白基因片段，连接到原核载体pUC19，转化大肠杆菌DH5α并用IPTG诱导表达。SDS-PAGE及Westernblot分析表明：外壳蛋白基因在大肠杆菌中获得了特异性表达，融合蛋白分子量约为35kD。 重点讨论了各种检测方法在实际中的应用，百合无症病毒提取过程中需要解决的问题，外壳蛋白基因在大肠杆菌中表达载体的构建。 研究结果建立了检测百合无症病毒的RT-PCR和核酸杂交检验检疫标准，构成了百合无症病毒的检测体系，得到表达外壳蛋白基因的大肠杆菌菌株，为其抗血清的制备打下了基础。

目录

文摘

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第一章文献综述

1.1百合病的发生和危害

1.2百合无症病毒

1.2.1百合无症病毒生物学特性

1.2.2百合无症病毒分子生物学特性

1.3植物病毒的检测技术

1.3.1生物学检测方法

1.3.2电镜技术

1.3.3血清学方法

1.3.4分子生物学方法

1.4百合无症病毒的检测方法研究

1.5百合脱毒研究进展

1.6本项目的研究目的及意义

第二章材料和方法

2.1实验材料及试剂

2.1.1实验材料

2.1.2试剂

2.2实验方法

2.2.1百合无症病毒生物学测定

2.2.2百合无症病毒的提取

2.2.3酶联免疫吸附法(ELISA)

2.2.4斑点酶联

2.2.5双抗夹心

2.2.6总RNA的提取

2.2.7 RT-PCR

2.2.8目的DNA的回收纯化

2.2.9质粒载体片段与外源片段的连接

2.2.10 DNA的限制性酶切

2.2.11大肠杆菌感受态细胞的制备

2.2.12连接反应物对宿主感受态细胞的转化和筛选

2.2.13微量碱裂解法提取质粒

2.2.14核酸杂交

2.2.15融合蛋白的诱导表达

2.2.16蛋白电泳

2.2.17 WESTERN-BLOT检测

第三章结果与分析

3.1生物学寄主反应测定

3.2百合无症病毒田间调查结果

3.3病毒提取结果

3.4 RT-PCR结果

3.4.1百合病叶总RNA的提取

3.4.2RT-PCR扩增结果

3.5序列测定结果

3.6核酸杂交实验结果

3.7检测方法比较结果

3.7.1血清学方法比较

3.7.2分子生物学方法比较

3.7.3检测灵敏度比较

3.8表达产物的检测和分析

第四章讨论

第五章结论

参考文献

附件

致谢

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