中国葡萄属野生种芪合成酶基因载体构建及转化烟草研究

摘要

白藜芦醇作为葡萄属植物的抗逆代谢物质—植保素(phytoalexin)，是葡萄属植物对病原菌或其它各种诱发因子胁迫下迅速在细胞中累积的一种次生代谢物质，它在细胞中的积累可以提高植物的抗病性。本研究是在获得中国葡萄属野生种华东葡萄白河-35-1芪合成酶基因(STS)的基础上构建中国葡萄属野生种芪合成酶基因植物表达载体，并将其转入根癌农杆菌GV3101中，然后通过农杆菌介导法将STS基因导入烟草，借以初步探讨芪合成酶基因在烟草中的转化和表达情况，为其今后在葡萄属植物上的应用提供依据。主要研究结果如下： 1.中国葡萄属野生种芪合成酶基因的克隆、序列测定 根据本课题组获得的中国葡萄属野生种华东葡萄白河-35-1芪合成基因cDNA全长序列，设计特异引物，并进行了修饰和改造，即增加了与植物表达载体pWR306相匹配的限制性内切酶酶切位点。 2.植物中间表达载体的构建及鉴定　　利用DNA重组技术，将质粒pSB166中包含ED35s-Ω-MCS-UTT-TNOS的一段核苷酸序列定向克隆到质粒pCAMBIA1303上，经酶切、电泳鉴定表明，已成功构建了植物中间表达载体pWR306。 3.中国葡萄属野生种芪合成酶基因植物表达载体的构建　　双酶切重组质粒pGEM-T-STS及表达载体pWR306，将STS基因片段与线性表达载体pWR306进行定向连接，构建了芪合成酶基因的植物表达载体pWR-STS,通过酶切、电泳鉴定，STS基因已成功构建到植物表达质粒pWR306中，将此克隆命名为pWR-STS。 4.重组质粒pWR-STS导入根癌农杆菌GV3101　　采用改进冻融法，将重组质粒pWR-STS导入农杆菌GV3101中，在卡那霉素和庆大霉素的平板上筛选阳性克隆，至有单菌落出现，进行菌落直接PCR和提取质粒、PCR扩增检测，结果表明重组质粒已导入农杆菌GV3101中。 5.烟草遗传转化及检测　　通过对影响农杆菌介导烟草遗传转化的几个主要因素的探讨，确定了各主要影响因素的值。利用绿色荧光蛋白检测系统，对转化细胞作了早期筛选鉴定，再通过PCR检测，初步证明芪合成酶基因已经导入烟草中。

目录

文摘

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第一部分文献综述

1.1葡萄白粉病

1.1.1葡萄白粉病的起源及分布

1.1.2葡萄属植物对白粉病抗性的遗传研究进展

1.1.3葡萄属植物对白粉病抗性的分子生物学研究进展

1.2葡萄属植物抗白粉病基因工程研究

1.2.1抗白粉病芪合成酶基因工程

1.2.2抗白粉病几丁质酶基因工程

1.3抗真菌基因工程策略及进展

1.3.1植物抗真菌病害基因工程的策略

1.3.2在植物与病原识别水平上调控而激活植物的抗病机制

1.3.3植物抗真菌基因的克隆方法

1.3.4导入植物防卫反应基因增强植物抗病性

1.3.5导入降解或抑制病原菌致病因子的基因使植物抗病

1.3.6几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶基因及其应用

1.4植物遗传转化方法

1.4.1载体介导法

1.4.2直接转化法

1.4.3种质系统介导法

1.5转基因植株的检测

1.5.1标记基因的应用

1.5.2分子检测

1.5.3免疫技术

第二部分试验研究

2.1本研究的目的意义

2.2材料和方法

2.2.1实验材料

2.2.2实验方法

2.2.3烟草遗传转化

2.3结果与分析

2.3.1 PCR扩增及酶切鉴定

2.3.2中间表达载体pWR306的构建及鉴定

2.3.3芪合成酶基因植物表达载体的构建及鉴定

2.3.4根癌农杆菌的转化及鉴定

2.3.5转化体筛选及植株再生

2.3.6 GFP检测

2.3.7转化幼苗的PCR检测

2.4讨论

2.4.1引物设计策略

2.4.2芪合成酶基因表达载体构建策略

2.4.3菌落直接PCR鉴定筛选重组子

2.4.4根癌农杆菌介导的烟草转化

2.4.5 GFP在转基因检测中的应用

2.5结论及展望

2.5.1结论

2.5.2问题及展望

参考文献

图版

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附录

致谢

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