间充质干细胞治疗三氯丙烷中毒性肝损伤

摘要

研究背景
　　现代工业的飞速发展,化学产品中毒事件不断增加,其中三氯丙烷高剂量中毒导致的严重中毒性肝损伤,病情恶化快,常规保肝药物、人工肝等治疗效果有限,最终导致肝衰竭死亡。文献报告骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)治疗病毒性肝炎,肝硬化,甚至肝脏移植后肝脏损伤,肝功能生化指标较对照组明显恢复。
　　利用BM-MSCs治疗中毒性肝损伤的体内、体外初期实验发现有减少肝脏细胞死亡,促进其再生的作用,但MSC针对三氯丙烷(TCP)中毒肝损伤治疗未见文献报道。因此,我们设计了MSC治疗大鼠TCP中毒肝损伤模型,回答MSC是否可以归巢中毒损伤肝脏,归巢后干细胞变化规律,能否起到肝损伤修复作用,MSC的安全有效剂量,以及通过腺病毒转染增效基因加强MSC修复功能等,为临床救治提供实验参照数据。
　　实验方法与结果
　　1.分离、培养和鉴定大鼠骨髓MSC
　　取SPF级Wistar大鼠100g-130g,雄性,全骨髓贴壁分离法培养大鼠骨髓间充质干细胞,至第4代镜下观察细胞贴壁生长,形态统一,呈一致的梭形或长条形。取4代MSCs分别行流式细胞仪细胞表型检测及成骨、成脂诱导分化实验,结果显示4代MSCs均表达CD105,CD44,不表达CD45和CD34,且在一定诱导条件下,成功向成骨、成脂肪诱导转化。这就说明我们用的全骨髓贴壁分离筛选法可以获得足够量、生长旺盛、高纯度、具有多向分化潜能的大鼠骨髓间充质干细胞。
　　2.三氯丙烷致肝损伤大鼠动物模型建立
　　取40只健康SPF级Wistar大鼠,雌性,体重200g±20g,随机分为4组,每组各10只。A组,正常对照组(注射生理盐水),B组,40ug/kg肝损伤模型组,C组,60ug/kg肝损伤模型组,D组,80ug/kg肝损伤模型组,隔日注射,分别在注射3次、5次、6次、7次取血标本,检验肝功能损害程度,检验项目包括:症状、体征,体重,及血液生化谷丙转氨酶(ALT)、血清总蛋白(TP)、血清白蛋白(Alb)、总胆红素(TBil)、直接胆红素(DBil)。,实验结果60ug/kg肝损伤模型组可出现明显肝脏中毒症状、体征,及肝脏病理,生化指标变化,而40ug/kg组相对损伤轻,恢复快,80ug/kg相对损伤重,动物早期死亡率高。
　　3.骨髓间充质干细胞在肝损伤大鼠肝脏归巢研究
　　用长效荧光标记剂CM-DiI标记MSC作体内示踪观察。具体方法:雄性大鼠的第4代6x106MSC细胞90％融合后,胰酶消化,用PBS稀释DMSO溶解CM-DiI染剂,放37℃5min。PBS液洗,悬浮。MSCs组:雌性大鼠三氯丙烷(TCP)染毒后1周,CM-DiI标记的雌性鼠的MSC1×106/只尾静脉输注;对照组,正常大鼠,不染毒,同样尾静脉输注MSC1×106。将移植后3、15和30d的大鼠处死,取其肝脏包埋剂包埋后放入液氮冷冻,病理切片机连续切片,倒置荧光显微镜观察照相。病理结果:正常大鼠输入MSC细胞后12天,发现MSC细胞在骨髓和肠道增生活跃。染毒大鼠移植后15d,可见在受者肝脏中有少量标记细胞,主要集中在汇管区,移植后30d,肝脏中标记细胞进一步增加,出现形态改变,荧光汇集成片向肝小叶分布。
　　4.骨髓间充质干细胞对三氯丙烷所致大鼠肝损伤的保护作用
　　75只SPF级Wistar大鼠,雌性,体重200g±20g,每组15只随机分为5组:A组(正常对照组);B组(肝损伤模型组TCP+PBS)腹腔注射质量分数为三氯丙烷60ug/kg,4h后经尾静脉注射1mlPBS;C组(高剂量MSCs治疗组TCP+MSC)腹腔注射质量分数为三氯丙烷60ug/kg,4h后经尾静脉注射MSCs,1×106/只(重悬于1mlPBS中);D组(低剂量MSCs治疗组TCP+MSCs)腹腔注射质量分数为三氯丙烷60ug/kg,4h后经尾静脉注射MSCs-EGFP,1×105/只(重悬于1mlPBS中);E组(MSCs对照组MSCs+PBS)腹腔注射等量的PBS,4h后经尾静脉注射MSCs,1×106/只(重悬于1mlPBS中)。观察各组大鼠的一般情况,血液肝功能,同时行肝组织病理学观察。结果显示MSCs治疗组大鼠肝损伤生化指标好于PBS组,差异有统计学意义(P<0.05)。
　　5.KGF基因通过腺病毒载体转染小鼠MSC实验研究
　　为了将角质生长因子(KGF)基因通过腺病毒载体转染到MSC中,增强MSC修复功能。利用DNA重组技术,将目的基因KGF克隆到含有报告基因EGFP的穿梭质粒中,然后再将构建的重组穿梭质粒转移至pAdxsi载体中,构建重组腺病毒载体质粒,继而在H293细胞中包装、扩增,并测定病毒滴度。转染至小鼠MSC中。为下步无关MSC输注及基因改造MSC保证及放大MSC修复功能的干细胞活性实验提供前期平台。
　　结论
　　1、全骨髓贴壁分离法可成功分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞,并在体外稳定培养。2、60ug/kg三氯丙烷可成功建立大鼠肝脏中毒实验模型。
　　3、荧光标记的MSCs可以在三氯丙烷中毒后损伤肝组织植入。
　　4、MSC可以归巢到TCP染毒的大鼠肝损伤动物模型,并出现增值现象,同时有效的促进了损伤肝脏血清生化指标的恢复,减轻了病理中毒损伤。验证了1X106MSC是安全有效的治疗剂量。为MSC治疗中毒性肝损伤患者提供有效的临床前期实验数据。
　　5.携带增KGF基因的腺病毒可以成功转染小鼠骨髓间充质干细胞

目录

封面

声明

目录

缩 略 词 表

中文摘要

英文摘要

前 言

技术路线

第一部分分离、培养、鉴定大鼠骨髓间充质干细胞

材 料 和 方 法

讨论

第二部分三氯丙烷致肝损伤大鼠动物模型建立

材料和方法

讨 论

第三部分骨髓间充质干细胞肝损伤大鼠肝脏归巢研究

材料和方法

结 果

讨论

第四部分骨髓间充质干细胞对三氯丙烷所致大鼠肝损伤的保护作用

材料和方法

讨 论

第五部分构建重组腺病毒并转染小鼠骨髓间充质干细胞

讨论

总结论

参考文献

文献综述

Reference

讨论

参考文献

个人简历

致谢