用烟草蚀纹病毒防治玉米矮花叶病的研究

摘要

玉米矮花叶病是玉米生产上的一类重要病毒病，在世界各玉米产区都有发生，长期以来一直严重影响着玉米的产量和质量。在我国，自1968年首次报道河南新乡发生玉米矮花叶病害以来，该病害在我国北部和西北部地区均大面积发生，玉米产量损失在20％～80％，已经成为制约我国玉米生产的主要问题之一。本文在克隆玉米矮花叶病毒CP基因的基础上，运用生物学和分子生物学手段研究了烟草蚀纹病毒(Tobacco etch virus,TEV)与甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus，SCMV)之间的交互保护作用，证实了TEV与SCMV之间存在交互保护作用的现象，这不仅为植物病毒马铃薯Y属(Potyvirus)不同病毒间交互保护作用的研究奠定了基础，而且也开拓了植物病毒病防治的新思路。 克隆了陕西分离物SCMV CP基因(登录号为DQ846832)，其基因序列与浙江SCMVCP基因的核苷酸同源率为99.79％，氨基酸的同源率为100％。 在防虫网室内，对TEV与SCMV交互保护作用设计了四种处理方式，处理I先用10％TEV保护接种玉米，7d后挑战接种10％SCMV，结果表明玉米在初期叶面光滑，色泽均匀， 10d后仅有13.8％的植株开始轻微褪绿，处理Ⅱ只挑战接种SCMV作为阳性对照的玉米，在前期心叶表现出褪绿症状，后期植株为典型玉米矮花叶症状；10d后全部发病。处理Ⅲ只保护接种TEV的玉米无症状，处理Ⅳ不接种任何病毒的玉米生长状况良好，健康无症状。 通过PCR检测，结果发现，从只接种SCMV的玉米植株中扩增片段大小约为1.1kb，确定为SCMV CP基因；从先接种TEV再接种SCMV植株中同样检测到该基因，但条带较弱，而不接种任何病毒植株对照均未出现特异性扩增条带。 进一步用实时荧光定量PCR检测，以只挑战接种的阳性对照为参照因子，其2<'-△△>u值是经18S rRNA校正后1倍量的目的基因表达，AACt=0，2<'-△△ct>=1，对于处理组的样品，相对于参照因子目的基因表达的倍数为2<'-△△ct>。经保护接种的玉米在攻击接种50d后，植株体内病毒cP含量为未保护玉米的0.1134倍，远远低于只接种SCMV植株的表达量。

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第一章文献综述

1.1玉米病毒病的概况

1.2交互保护作用的研究历史及现状

1.2.1同种病毒间的交互保护作用

1.2.2不同病毒间的交互保护作用

1.2.3植物病毒间的交互保护作用的机理

1.3玉米矮花叶病毒研究进展

1.4实时荧光定量PCR检测技术

1.4.1荧光探针技术原理

1.4.2 TaqMan探针

1.4.3 SYBR Green荧光染料

1.4.4绝对标准曲线法

1.4.5相对标准曲线法

1.4.6扩增效率系统误差的校正

1.4.7绝对分子含量的计算

1.4.8相对分子含量的计算

1.5本研究的目的和意义

第二章玉米矮花叶病毒CP基因的克隆

2.1材料

2.2所需仪器和试剂耗材

2.2.1仪器

2.2.2菌种、质粒和试剂

2.3陕西分离物SCMV CP基因的克隆及测序

2.3.1病毒RNA的提取和cDNA的合成

2.3.2 SCMV CP基因的克隆

2.3.3 PCR产物纯化

2.3.4连接反应

2.3.5感受态细胞的制备

2.3.6转化和筛选

2.3.7重组质粒的鉴定

2.3.8序列测定与同源性分析

2.4结果与分析

2.4.1 RNA的提取及检测

2.4.2 SCMV CP基因的扩增

2.4.3 SCMV CP基因测序结果

2.4.4SCMV CP基因的同源性分析

2.5讨论

第三章TEV与SCMV之间的交互保护作用

3.1材料

3.1.1供试植物材料

3.1.2供试毒源

3.2试验方法

3.2.1生物防治试验处理

3.2.2常规PCR检测

3.2.3实时荧光定量RT-PCR法检测TEV与SCMV之间的交互保护作用

3.3结果与分析

3.3.1生物学结果

3.3.2 PCR检测结果

3.3.3 Real-time PCR检测结果

3.4讨论

第四章主要结论与研究设想

4.1主要结论

4.2研究设想

参考文献

致谢

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