蛇毒纤溶酶Alfimeprase在毕赤酵母中的表达、纯化及活性鉴定

摘要

血栓性疾病是严重危害人类健康的疾病之一，而利用溶栓剂治疗血栓病的溶栓疗法被认为是最为有效的方法。据统计，全世界每年有血栓栓塞性病人约1700万，所需的溶栓剂的潜在市场约20亿美元。因此，寻找和研制新型、高效、安全的溶栓药物并实现高效高活性表达，对于更有效地治疗血栓性疾病具有十分重要的意义。 Fibrolase是来自美国铜头蝮蛇毒的一种锌金属蛋白酶，具有纤溶活性而无出血活性。Alfimeprase(ALF)是Fibrolase的N端突变体体(前3个氨基酸EQR曲Ser取代)，与Fibrolase具有同样的溶栓功能，由美国Nuveo公司研制开发并申请了专利，其Ⅰ期关于治疗慢性周围动脉血栓(PAO)和Ⅱ期关于治疗周围静脉导管栓塞病(CVAD)的临床试验结果显示，ALF不仅是一种直接快速呈剂量相关的溶栓剂，而且很有希望成为第一个快速、高效、安全的蛇毒基因工程溶栓药物，现已开始用于治疗急性PAO和CVAD的Ⅲ期临床试验。 由于毕赤酵母(P. pastoris)表达系统是目前较完善的高效异源蛋白表达系统，具有高分泌表达、高稳定整合、易于高密度发酵和产物的下游纯化等优点，所以本研究采用该系统对ALF的高效高活性表达进行了研究。研究通过双酶切从构建好的克隆载体p43-alf上获取目的基因his6-alf,将其克隆至毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K和pPICZα A，经高效电转化、筛选鉴定、甲醇诱导表达获得了重组ALF(rALF)高表达菌株GS115/pPIC9K-his6-alf,KM71/pPIC9K-his6-alf和GS115/pPICZα A-his6-alf. SDS-PAGE和Western blotting分析表明rALF的分子量约为23.8 kDa，且能与小鼠抗His·tag的单克隆抗体特异结合，这说明rALF获得了特异表达。通过对培养条件pH、每天甲醇流加终浓度、菌体生长密度和诱导时间的优化，三种重组菌中rALF的表达量分别高达510 mg/L、465 mg/L和425 mg/L。同时可见pPIC9K-his6-alf组菌中KM71重组菌比GS115重组菌表达的rALF更纯，而GS115重组菌单位体积表达液中rALF的表达量更大。三种重组菌的优化表达液经His·bina柱纯化后，rALF纯度分别高达94.8％、96％禾1195％。纤维蛋白平板法纤溶活性鉴定结果表明rALF获得了高活性分泌表达，且其纤溶活力呈现出剂量相关性和时间依赖性。另外，rALF的电泳检测和混合纤溶活性测定分析结果显示：对于rALF的高效高活性分泌表达而言，pPIC9K载体相对较优越于pPICZα A载体，而GS115和KM71菌株之间的优越性并无明显差别。结论：研究通过系列操作确立了一种高效高活性优化表达体系，为ALF的深入研究和工业化生产应用奠定了重要基础。

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第一章文献综述

1.1血栓病治疗研究进展

1.1.1血栓形成及溶栓疗法

1.1.2新型溶栓剂的构建策略

1.2蛇毒毒纤溶酶研究进展

1.2.1蛇毒纤溶酶特性

1.2.2蛇毒纤溶酶的应用及前景展望

1.2.3 Alfimeprase

1.3毕赤酵母表达系统

1.3.1毕赤酵母表达载体和菌株

1.3.2外源基因在毕赤酵母中的表达

1.3.3毕赤酵母表达系统前景展望

1.4立题依据及实验技术路线

第二章实验部分

2.1材料

2.1.1载体和菌株

2.1.2主要试剂

2.1.3毕赤酵母表达溶液及培养基

2.1.4主要仪器

2.1.5引物

2.2方法

2.2.1表达载体构建

2.2.2电转化及重组菌的筛选

2.2.3重组菌的鉴定

2.2.4目的蛋白的诱导及Western Blotting鉴定

2.2.5目的蛋白的表达优化

2.2.6目的蛋白纯化

2.2.7纤溶活性测定

2.3结果与分析

2.3.1表达载体构建

2.3.2重组菌的筛选鉴定

2.3.3 rALF的诱导表达及Western Blotting鉴定

2.3.4 rALF的表达优化

2.3.5 rALF的纯化

2.3.6纤溶活性测定

2.4讨论

2.5总结

参考文献

附录

致谢

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