小鼠精原细胞体外培养特性及冷冻保存

摘要

精原干细胞(spermatogonial stem cells，SSCs)是精子发生的干细胞，是成年动物体内具备自我更新和多向分化潜能的二倍体永生细胞群。十几年来，SSCs移植技术的发展为SSCs的相关研究提供了极大便利，使SSCs的研究更加深入。为了给小鼠SSCs的体外分化、转基因、移植等体外操作提供理论依据和技术方法，本研究主要进行了小鼠精原细胞(含SSCs)的体外培养特性及冷冻保存研究。结果如下： 1、为研究小鼠精原细胞的体外存活、增殖特性，优化其体外培养体系，本实验利用7日龄昆白系小鼠睾丸，一步酶法分离获得生精上皮单细胞悬液(主要含精原细胞和支持细胞)，分别接种于D-MEM、D-MEM/F12和KSOM后系统研究了精原细胞的存活和增殖情况。结果显示，小鼠精原细胞在D-MEM和D-MEM/F12中均能存活并增殖，表现为在培养的第1～9天/1～8天呈逐渐减少趋势，第9～13天/8～12天呈增殖趋势，第17天/16天以后增殖减缓，而小鼠精原细胞在KSOM中只短暂存活不能增殖。 2、为摸索小鼠精原细胞单细胞形式以及功能性结构形式(曲细精管和完整睾丸)冷冻保存方法，本实验以10％DMSO为冷冻保护剂，对生精上皮单细胞、曲细精管及完整睾丸进行了-70℃冷冻保存，同时对生精上皮单细胞进行了液氮冷冻保存，并对冻存后细胞进行了培养。结果显示，完整睾丸、曲细精管及生精上皮单细胞经1周冻存复苏后细胞存活率分别为85.754±2.24％、93.284±0.37％和90.21±0.89％，曲细精管经2周冻存复苏后细胞存活率为91.27±0.39％，生精上皮单细胞经2周、1个月和3个月液氮冻存复苏后细胞存活率分别为91.17±1.47％、90.51±1.34和89.73±2.51％。复苏后精原细胞培养第10天出现旺盛增殖行为。 3、为探索小鼠精原细胞的纯化方法，验证小鼠精原细胞无饲养层培养的可行性。本实验用机械震摇法对处于旺盛增殖期的精原细胞集落进行了纯化，并分别接种于未包被培养板及明胶包被培养板后进行培养，详细观察了精原细胞的培养特性。结果显示，该纯化方法效果较为理想，纯化的精原细胞在无饲养层培养(包被或不包被培养板)条件下能够存活20～25天，但未观察到明显的增殖现象，集落中精原细胞形态(由外周到中心)由圆形或微卵圆形逐渐演化为带尾的精子样细胞，表现出分化迹象。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一部分文献综述

第一章精原干细胞研究进展

1.1精原干细胞的起源

1.2精原干细胞的生物学特性

1.3精原干细胞的分离、纯化及鉴定

1.4精原干细胞的体外培养

1.5精原干细胞移植

第二章精原干细胞及睾丸组织冷冻保存研究进展

2.1细胞的冷冻生物学

2.2精原干细胞及睾丸组织冷冻保存

第二部分实验研究

第三章小鼠精原细胞体外存活及增殖特性

3.1材料与方法

3.2结果

3.3讨论

第四章小鼠精原细胞冷冻保存研究

4.1材料与方法

4.2结果

4.3讨论

第五章小鼠精原细胞的纯化及无饲养层培养

5.1材料与方法

5.2结果

5.3讨论

结论

参考文献

附录

致谢

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