类风湿性关节炎中重要信号转导通路阻断剂的制备及其功能研究

摘要

盘状结构域受体(discoidin domain receptors，DDRs)属于一种受体型蛋白酪氨酸激酶，蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinases，PTKs)是一大类介导细胞增殖或凋亡的相关信号转导分子。DDRs分子不仅与细胞增殖相关，还与细胞过分泌MMPs相关。它参与了许多细胞生理进程，如细胞增殖、分化、迁移和代谢，尤其是在控制软骨细胞增殖和骨骼生长中发挥重要作用。DDR2是类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)病理进程中起重要作用的分子之一。在RA滑膜细胞中，DDR2呈高表达状态，并具有较高的的磷酸化水平。它被胶原活化，介导基质金属蛋白酶(matrix metallo- proteinases，MMPs)的表达，MMPs作用于关节软骨，最终造成关节软骨不可逆的破坏。因此，本研究制备了Ⅱ型胶原-DDR2-MMPs这一信号通路的阻断剂，使其阻断DDR2介导的MMPs持续分泌，期望将来为临床上治疗RA提供新的候选药物。本研究主要取得了以下结果： 1．成功构建了DDRs/IgG融和表达载体，并在HEK293细胞和CHO细胞中进行了表达鉴定。本实验对DDR2的DS domain与IgG的Fc段进行了融合表达，DS domain是DDRs结合其配体——Ⅱ型胶原的有效区域，之所以将它和Fc段进行融合，目的是利用Fc的二硫键使DDR2 DS domain形成二聚体，使其具备与Ⅱ型胶原结合的构象，通过竞争性结合Ⅱ型胶原而抑制它与天然受体结合，进而阻断Ⅱ型胶原-DR2-MMPs这一信号通路。 2．利用CHO细胞表达系统，通过稳定转染和压力筛选，获得了强表达DDR2/Fc融合蛋白的单克隆细胞株。 3．通过大量培养阳性细胞株，收集培养上清后，利用蛋白A亲和层析，对融合蛋白进行回收与纯化，结果表明蛋白表达量在1.14 μ g/mL (7.98 μ g/10<'7>cell)。 4．经过竞争性结合抑制实验和细胞实验，证明制备出的竞争性阻断剂——DDR2/Fc融合蛋白在体外具备一定的阻断功能。 5．构建了DDR2/Fc重组腺病毒载体，并初步包装了相关重组腺病毒，期望获得高滴度的重组腺病毒，用于感染RA动物模型进行动物实验。

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第一章文献综述

1.1类风湿性关节炎发病机理的研究进展

1.1.1自身抗体产生机制及自身抗原的筛选

1.1.2 T细胞活化

1.1.3细胞因子作用

1.1.4遗传因素

1.1.5滑膜细胞增生机理

1.2蛋白酪氨酸激酶DDRs的研究进展

1.2.1 DDRs的发现

1.2.2 DDRs的结构

1.2.3 DDRs的组织分布

1.2.4 DDRs的配体研究

1.2.5 DDRs的功能研究

1.3 Ⅱ型胶原-DDR2-MMPs信号通路在RA发病机制中的重要作用

1.3.1 MMPs的分类和组织分布

1.3.2 MMPs的分子结构及性质

1.3.3 MMPs分子在关节软骨侵蚀中的作用

1.3.4 Ⅱ型胶原-DDR2-MMPs信号通路在RA关节病变中的意义

1.3.5其他信号转导通路的作用

1.4 CHO细胞表达系统和腺病毒表达系统

1.4.1 CHO表达系统

1.4.2腺病毒表达系统

1.5研究设想和技术路线

1.5.1研究设想

1.5.2技术路线

第二章真核表达载体DDRs/Fc-pcDNA3.1(-)的构建及在HEK293和CHO细胞中的表达

2.1材料与方法

2.1.1材料

2.1.2方法

2.2结果与分析

2.3讨论

第三章DDR2/Fc融合蛋白在CHO细胞中的稳定表达纯化及功能验证

3.1材料与方法

3.1.1材料

3.2方法

3.3结果与分析

3.4讨论

第四章相关重组腺病毒的包装

4.1材料与方法

4.1.1材料

4.1.2方法

4.2结果与分析

4.3讨论

第五章结论

参考文献

附录

致谢

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