辣椒疫病抗性相关基因的克隆与分析

摘要

辣椒疫病(Phytophthora capsici Leon)是一种世界性的辣椒病害，已有60多年的历史。近年来，在我国许多省市发生危害，且为害程度逐年加重。辣椒疫病传播途径较多，选育抗疫病品种是防止或减轻辣椒疫病危害的有效途径，目前世界上许多辣椒主产国均已把选育抗疫病品种作为辣椒育种工作的主要目标之一。 本研究以感病品种B27、中抗品种A3、高抗疫病品种All为试验材料。用辣椒疫霉菌诱导处理6叶期幼苗，接种后0h，12h，24h分别采摘叶片，进行基因差异表达分析，并对得到的差异片段进行分析，利用RACE技术最终获得全长cDNA。主要结果如下： 1.筛选了DDRT—PCR体系中各反应因素的浓度，建立了辣椒疫病抗性相关基因DDRT-PCR体系。优化后25μL体系中各组分浓度为：cDNA第一链反应产物2.0μL(反转录反应体系中总RNA 2.0μg，锚定引物6.25μmol/L)，锚定引物2.5μmol/L，随机引物2.5μmol/L，dNTP 250μmol/L，MgCl2 2.0mmol/L，10xBuffer 2.5μL，Taq酶1.0U，ddH2O补齐体积。 扩增程序为：94℃ 3min；94℃ 45s，45℃ 2min，72℃ 1min，40个循环，72℃延伸8min，4℃保存。 2.利用mRNA差异显示技术，研究辣椒疫病不同抗性品种接种前后抗病相关基因的表达差异，获得了辣椒抗疫病相关基因片段7条：T12C/B0312-251、T12C/B0312-248、T12G/B0312-339、T12C/B0307-170、T12G/B0317-374、T12A/B0320-235、T12A/B0320-195。 3.经BLAST检索，发现T12C/B0312.251(GenBank登录号EU280142)与粉蓝烟草的推测编码ml基因的部分mRNA有90％的同源性：T12C/B0312-248(GenBank登录号EU280143)与辣椒编码区序列ERD15 mRNA有99％的同源性：T12G/B0312-339(GenBank登录号EU280144)与番茄mRNA序列113946R克隆有92％的同源性，片段T12C/B0307-170，T12G/B0317-374，T12A/B0320-235，T12A/B0320-195未发现其与已报导的序列有同源性，为辣椒特有的eDNA序列。 4.根据差异片段T12C/B0312-251的序列设计特异引物，利用5’RACE与3’RACE分别获得大小为415bp和441bp的两端序列，其中有57bp的重叠序列，根据重叠部分将其拼接成一条大小为799bp的完整cDNA序列。利用BLAST软件对其进行同源性比较发现，该序列与ml基因高度同源。

目录

文摘

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声明

第一章文献综述

1.1辣椒疫病的研究进展

1.1.1辣椒疫病的主要症状

1.1.2辣椒疫病的病原学研究

1.1.3辣椒疫病的发生发展规律

1.1.4辣椒疫病的防治

1.1.5辣椒抗疫病育种研究进展

1.2 mRNA差异显示技术及其研究进展

1.2.1 mRNA差异显示技术的原理

1.2.2 mRNA差异显示技术的优缺点

1.2.3 mRNA差异显示技术的改进与发展

1.2.4 mRNA差异显示技术在植物研究上的应用

1.3本研究的目的和意义

第二章材料与方法

2.1材料

2.1.1供试材料

2.1.2菌株与质粒

2.1.3供试生化试剂及酶类

2.1.4主要仪器设备

2.1.5 PCR引物

2.2方法

2.2.1病原菌准备及接种

2.2.2总RNA的获得

2.2.3 cDNA第一链合成

2.2.4 DDRT-PCR

2.2.5 6％聚丙烯酰胺凝胶电泳

2.2.6银染

2.2.7差异cDNA片段回收和二次PCR扩增

2.2.8差异cDNA片段的克隆

2.2.9抗病相关基因全长的获得

第三章结果与分析

3.1辣椒总RNA提取

3.2 mRNA差异显示分析

3.2.1适于辣椒DDRT-PCR引物组合的筛选

3.2.2差异cDNA片段的获得

3.2.3差异cDNA片段的二次PCR扩增

3.3差异cDNA片段的克隆与测序

3.4抗病相关基因全长的获得

3.5差异cDNA片段的序列分析

3.5.1抗辣椒疫病特有cDNA片断的同源性分析

3.5.2差异cDNA片断T12C/B0312-251的同源性分析

3.5.3差异cDNA片断T12C/B0312-248的同源性分析

3.5.4差异cDNA片断T12G/B0312-339的同源性分析

3.6 cDNA全长序列获得及序列分析

第四章讨论

4.1植物材料选择

4.2辣椒mRNA差异显示体系的建立

4.3差异片断的获得

4.4差异显示片断同源性比较

4.5差异显示技术在抗病基因克隆上的应用前景

第五章结论

参考文献

致谢

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