鸡新城疫病毒F48E9的纯化及其HN基因片段的原核表达

摘要

实验室一般采用差速离心和密度梯度离心的方法来纯化病毒，这种方法在工业上难以大量推广。而人用疫苗的纯化则多采用超滤，层析等方法，由于成本较高，在兽用疫苗上很难普遍采用。本研究借鉴蛋白质提纯的相关方法，利用硫酸胺、冷乙醇和PEG6000对鸡新城疫病毒进行了初步提纯，并用红细胞血凝实验对浓缩效果进行了检测，结果发现终浓度为40％时硫酸铵对鸡新城疫病毒的浓缩效果最好，可将病毒的血凝效价提高32倍；在冷乙醇终浓度为30％时对病毒的浓缩效果最好，可以将病毒的血凝效价提高8倍；PEG6000的终浓度为20％时对鸡新城疫病毒的浓缩效果最好，可将病毒的血凝效价提高16倍。本研究结果给兽用疫苗的纯化提供了一定的借鉴意义。 新城疫是由新城疫病毒引起的禽类的一种急性、高度接触性传染病，在世界范围内均被认为是家禽和鸟类最重要的两大疾病之一。目前鸡新城疫尚无有效的治疗药物，疫苗接种是控制其爆发的主要手段，其中基因工程疫苗具有广阔的发展前景。同时鸡新城疫病毒的相关单克隆抗体己广泛用于病毒抗原表位和发病机理，疫病诊断和流行病学分析等各项研究中。本研究选取了鸡新城疫病毒标准中国强毒株F48E9 HN基因中基本上包含了其主要抗原位点的两个基因片段，通过RT-PCR技术，成功地获得了这两个不交叉的基因片段，长度分别为790bp和579bp。而后将这两段基因分别克隆到了pGEM-Tvector中，经PCR和酶切鉴定后进行测序，测序结果表明这两段基因已经成功地克隆到了pGEM-T vector中。 克隆出的两个HN基因片段HN1、HN2与原核表达系统pET-28a(+)进行了连接，成功地构建了重组表达载体，并在大肠杆菌BL21(DE3)中得到了表达；由于pET-28a(+)表达载体在起始密码子之后有His(Tag)标记，表达的目的融合蛋白N端含有His，能与Ni柱中的Ni2+结合，而其它蛋白不能结合在Ni柱上，所以利用Ni亲和层析柱对表达的目的蛋白进行了纯化，通过SDS-PAGE电泳检测，检测出了经过纯化的目的蛋白。 本研究中得到的两个HN蛋白为进一步进行鸡新城疫病毒的相关单克隆抗体研究和基因工程疫苗研究打下了基础。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章文献综述

1.1鸡新城疫病毒的基本特征

引言：

1.1.1新城疫病毒的形态

1.1.2新城疫病毒的分类

1.1.3新城疫的理化性质

1.1.4新城疫病毒的复制

1.2新城疫病毒的基因及其相应的蛋白质

1.2.1新城疫病毒的基因组结构特征

1.2.2 HN基因及HN蛋白

1.2.3 F基因及F蛋白的分子结构特征

1.2.4 P基因及P蛋白

1.2.5 M基因及M蛋白

1.2.6 NP和L基因及其蛋白

1.3 NDV致病性的分子生物学基础

1.4 NDV的分子生物学检测方法

1.4.1单克隆抗体技术

1.4.2 RNA指纹图谱技术

1.4.3核酸探针技术

1.4.4反转录一聚合酶链反应(RT-PCR)技术

1.4.5抗多肽抗体法

1.5 ND疫苗研究现状

1.5.1活疫苗

1.5.2灭活疫苗

1.5.3核酸疫苗

第二章新城疫病毒F48E9几种纯化方法的比较研究

2.1实验材料

2.1.1病毒株

2.1.2实验动物

2.1.3生物试剂及有关药品

2.1.4主要仪器和设备

2.2实验方法

2.2.1新城疫病毒在鸡胚中的增殖

2.2.2新城疫病毒纯化前的预处理

2.2.3新城疫病毒的浓缩沉淀

2.3实验结果

2.3.1初始血凝效价测定结果

2.3.2硫酸铵沉淀结果

2.3.3乙醇沉淀结果

2.3.4聚乙二醇沉淀结果

2.4讨论

2.5小结

第三章新城疫病毒F48E9两个HN基因片段的克隆

3.1实验材料

3.1.1毒株与菌株

3.1.2实验动物

3.1.3主要要酶类和生物试剂

3.1.4主要仪器和设备

3.1.5主要试剂配制

3.1.6引物设计

3.2实验方法

3.2.1 NDV F48E9的增殖

3.2.2 NDV F48E9总RNA的提取

3.2.3 RT-PCR反应

3.2.4 PCR产物的回收与纯化

3.2.5回收产物与pGEM-T载体的连接与转化

3.3实验结果

3.3.1 RT-PCR结果

3.3.2重组质粒的酶切鉴定结果

3.3.3重组质粒测序结果

3.4讨论

3.5 小结

第四章新城疫病毒F48E9两个HN基因片段的原核表达

4.1实验材料

4.1.1毒株与菌株

4.1.2主要要酶类和生物试剂

4.1.3主要仪器和设备

4.1.4主要试剂配制

4.2技术路线示意图

4.3实验方法

4.3.1表达载体pET-28a(+)质粒的制备

4.3.2重组表达质粒pET-HN1，pET-HN2的构建

4.3.3重组表达质粒pET-HN1，pET-HN2的鉴定

4.3.4诱导目的蛋白的表达

4.3.5目的蛋白的SDS-PAGE分析

4.3.6目的蛋白的纯化

4.4实验结果

4.4.1重组表达质粒pET-HN1和pET-HN2 PCR及酶切鉴定

4.4.2重组蛋白的表达

4.4.3目的蛋白的纯化

4.5讨论

4.6结论

参考文献

致谢

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