ATGL在Leptin介导脂解过程中的表达调控及其机理研究

摘要

脂肪组织中的甘油三酯在维持机体能量平衡过程中起着重要的作用。它的水解是一系列有序调控的过程，在不同的过程中有不同的酶参与。新近发现的脂肪酶ATGL特异性地水解甘油三酯，是甘油三酯水解的主要限速酶。同时它与游离脂肪酸的浓度、葡萄糖耐受性及胰岛素敏感性紧密相关。因此，它的表达调控很受关注。脂肪细胞因子leptin可以提高脂肪细胞的脂肪分解，诸多现象表明，ATGL在leptin调控脂解过程中可能发挥着重要的作用。但ATGL在leptin促脂解过程中的表达变化及其机理至今还没有被直接和系统地研究。 因此，本实验以与人类生理生化等方面最为相似的猪为模式动物，采用RT-PCR、细胞培养、甘油和FFA释放量测定、半定量RT-PCR、Western Blot等方法克隆了猪ATGL的全长CDS，研究了ATGL在leptin促脂解中的表达变化，并初步探讨了其机理。取得以下主要结果： 1、成功克隆了猪ATGL基因全长CDS，长度为1446 bp，GenBank登陆号为EU373817。与GerrBank已发表的人和小鼠的ATGL基因进行序列比对，同源性分别为87％和82％，这说明猪ATGL基因与人和小鼠在核苷酸水平有较高的同源性，暗示他们之间具有相似的功能和表达调控。猪ATGL基因全长CDS的克隆为研究ATGL在leptin促脂解过程中的表达变化奠定了一定的基础。 2、明确了leptin呈浓度依赖性促进猪脂肪细胞的脂解。与对照组相比，5、20和50ng/mL的Leptin均可显著促进甘油的释放(P<0.01)，并且leptin呈浓度依赖性促进甘油的释放，其中促进甘油最大释放的浓度为50 ng/mL；而与对照组相比，5、20和50 ng/mL，的leptin均可降低FFA的释放，但差异不显著(P>0.05)。 3、从体内和体外两个水平研究了ATGL mRNA和蛋白在leptin介导脂解过程中的表达调控，首次发现了在leptin介导脂解的过程中，ATGL mRNA表达升高的同时却伴随ATGL蛋白表达的下降。在体外猪脂肪细胞上的研究表明，ATGL mRNA的表达随着leptin浓度的增加不断升高，而ATGL的蛋白却不断降低；在活体皮下脂肪组织上的研究表明，ATGL mRNA和蛋白的表达与血清中leptin的水平密切相关，高水平的leptin伴随ATGL mRNA的高表达，但同时伴随ATOL蛋白的低表达。 4、初步研究了ATGL在Leptin介导脂解过程中的表达调控机理，发现了ATGL在lenin介导脂解中的表达受到JAK-STAT信号通路、MAPK信号通路和PPARγ的共同调控。JAK-STAT信号通路和MAPK信号通路的特异性抑制剂AG490和SB205380分别使ATGL mRNA的表达下调35.02％和23.26％，但与对照组相比，都显著提高ATGL蛋白的表达；PPAR γ的特异性抑制剂GW9662和激动剂rosiglitazone分别使ATGL mRNA的表达上调8.1 6％和下调1 8.26％，并相应地使ATGL蛋白表达显著下调和上调。

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文摘

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论文说明:缩略词表

声明

文献综述 第一章甘油三酯脂解的研究进展

1.1甘油三酯的脂解过程及其主要参与的脂解酶

1.1.1甘油三酯水解成甘油二酯过程中主要参与的脂解酶

1.1.2甘油二酯水解成甘油一酯过程中主要参与的脂解酶

1.1.3甘油一酯水解成甘油过程中主要参与的脂解酶

1.1.4脂解过程中主要参与的脂滴相关蛋白

1.2参与甘油三酯脂解调控的因素

1.2.1儿茶酚胺类

1.2.3胰岛素

1.2.4旁分泌和自分泌调控

文献综述 第二章Leptin的促脂解作用及其信号转导途径研究

2.1 Leptin

2.1.1 Leptin的结构

2.1.2 Leptin主要由白色脂肪组织分泌

2.1.3 Leptin的分泌调节

2.2 Leptin参与脂代谢的生物学功能

2.2.1 Leptin与能量平衡

2.2.2 Leptin与脂肪代谢

2.3 Leptin的信号转导途径

2.3.1 JAK-STAT信号通路

2.3.1 MAPK信号通路

2.3.3 PI-3激酶信号通路

文献综述 第三章ATGL的表达、调控及其机理的研究进展

3.1 ATGL的表达和调控研究进展

3.1.1 ATGL的组织部位和时序表达差异

3.1.2营养、激素和细胞因子等对ATGL的调控

3.2 ATGL的表达调控机理研究进展

3.2.1调控ATGL的途径研究进展

3.2.2 PKA途径对ATGL的调控

3.3展望

前言

实验研究 第四章猪ATGL基因的克隆及序列分析

4.1材料和方法

4.1.1实验材料

4.1.2实验方法

4.2结果分析

4.2.1组织提取RNA的完整性

4.2.2 PCR扩增结果

4.2.3扩增产物的分离和鉴定

4.2.4菌液PCR鉴定

4.2.5克隆测序

4.2.6同源性比对分析及GenBank登陆

4.3讨论

实验研究 第五章Leptin呈浓度依赖性促进猪脂肪细胞的脂解

5.1实验材料和方法

5.1.1实验材料

5.1.2实验方法

5.1.3统计分析

5.2结果与分析

5.2.1猪脂肪细胞的鉴定

5.2.2不同浓度Leptin对甘油释放的影响

5.2.3不同浓度Leptin对FFA释放的影响

5.3讨论

实验研究 第六章ATGL在Leptin促脂解中的表达调控

6.1实验材料和方法

6.1.1实验材料

6.1.2实验方法

6.1.3统计分析

6.2结果与分析

6.2.1体外ATGL在Leptin介导脂解过程中的表达

6.2.2体内ATGL的表达与血清中Leptin的水平相关

6.3讨论

实验研究 第七章ATGL在Leptin介导脂解过程中的表达调控的机理研究

7.1实验材料和方法

7.1.1实验材料

7.1.2实验方法

7.1.3统计分析

7.2结果与分析

7.1.1 JAK-STAT通路对Leptin调控ATGL表达的影响

7.2.2 MAPK通路对Leptin调控ATGL表达的影响

7.2.3 PPARγ对Leptin调控ATGL表达的影响

7.3 讨论

结论

有待于进一步完善或深入研究的问题

参考文献

致谢

作者简介

附录